Patterns of changes in the fluorescence of nadh and fad coenzymes and their relationship in skeletal muscle in the early post-mortem period (an experimental study)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Проблема определения давности наступления смерти (ДНС) является одной из основных в науке и практике судебной медицины. Начиная с середины двадцатого века, когда в судебно-медицинской танатологии стали активно использоваться биохимические, биофизические, физические методы, по настоящее время отечественными и зарубежными исследователями интенсивно разрабатываются и совершенствуются методы определения ДНС. К сожалению, большинство разработанных методов, позволяющих с высокой точностью определить ДНС, так и не были внедрены в экспертную практику, что обусловлено зачастую сложностью исполнения, их дороговизной или отсутствием серийных приборов [1]. Однако трудности внедрения в практику полученных результатов и новых методов нисколько не обесценивают исследования в данной области, так как изучение темпов посмертных изменений в органах, тканях, клетках позволяет выяснить, уточнить механизмы умирания и дезорганизации биологических структур и их функций, что имеет большое значение в клинической и фундаментальной медицине. В. Н. Крюков отмечал значимость результатов исследований «ранних посмертных изменений с помощью современных лабораторных методов … для трансплантологов, реаниматологов, патофизиологов, биохимиков и представителей других медицинских специальностей» [2]. Разработка методов определения ДНС в раннем постмортальном периоде находится в тесной связи с изучением устойчивости тканей к гипоксии и аноксии, а также механизмов и закономерностей тканевого метаболизма в условиях аноксии. Следовательно, посмертные процессы, происходящие в тканях, должны рассматриваться не только в прикладном аспекте, но и в фундаментальном.

Новым направлением, разрабатываемым в настоящее время кафедрой судебной медицины РУДН совместно с НИИ общей реаниматологии В. А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии, является изучение закономерностей посмертного метаболизма в переживающих тканях методом лазериндуцированной спектроскопии. Использование интенсивности аутофлуоресценции коферментов НАДН и ФАД в ультрафиолетовом и синем спектрах соответственно, а также их отношение в качестве маркеров окислительно-восстановительных процессов обусловлено множеством исследований в области биологии, клинической и фундаментальной медицины, которые доказали возможность использования показателей аутофлуоресценции внутриклеточных коферментов с целью оценки метаболической и митохондриальной активности [3–5]. Выбор метода лазериндуцированной спектроскопии продиктован простотой использования, а также возможностью проводить исследование in situ, не изымая и не подготавливая ткань.

Ранее в результате проведенного нами экспериментального исследования была выявлена зависимость интенсивности флуоресценции коферментов НАДН, ФАД и редокс-отношения в скелетной мышце от времени после смерти [6].

Цель исследования — обоснование закономерности изменения интенсивности флуоресценции коферментов НАДН, ФАД и их отношения в скелетной мышце в первые сутки после смерти с помощью математического моделирования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперимент проведен на самцах и самках крыс линии Sprague Dawley (n = 30) с массой 250–300 г в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Протокол проведения эксперимента был одобрен Локальным биоэтическим комитетом ФНКЦ РР. Перед проведением исследования животные находились в одинаковых условиях. Эвтаназию осуществляли цервикальной дислокацией под общей анестезией хлоралгидратом. Трупы животных находились при комнатной температуре.

Измерения интенсивности флуоресценции коферментов ФАД и НАДН проводились при жизни под общей анестезией хлоралгидратом, через 5 мин после смерти, каждые 1,5 ч или 3 ч (в случае необходимости перерыва в работе аппарата) в течение 24 ч посмертного периода. Для оценки интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД использовали лазерный диагностический аппарат «Лазма МЦ-3» (ООО НПП «Лазма», Россия, № РЗН 2015/3142 от 29.10.2015) с зондирующем излучением с длиной волны 365 нм (UV) и 450 нм (B) с программным обеспечением. Доступ к мышце бедра крысы обеспечивали через разрез кожи длиной 1 см, устанавливали волоконно-оптический зонд анализатора коферментов на участок поверхности скелетной мышцы. Измерение исследуемых показателей проводилось в течение 4 мин у каждого животного.

Показатели флуоресценции НАДН, ФАД, РО были автоматически рассчитаны программным обеспечением к аппарату «Лазма МЦ-3» (ООО НПП «ЛАЗМА», Москва), зафиксированы и сохранены в ПК.

Полученные данные анализировали методом нелинейного регрессионного анализа. Вывод, оценку точности и значимость коэффициентов уравнения регрессии проводили с использованием программы SigmaPlot 10.0. Проверку значимости модели регрессии проводили с использованием F-критерия Фишера. Анализ коэффициентов регрессионной модели проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Возрастание средних значений показателей флуоресценции НАДН было отмечено с 5-й мин посмертного периода. Пик флуоресценции отмечался в 3 ч, а с 4,5 до 24 ч — постепенное снижение. Средние значения интенсивности флуоресценции ФАД менялись незначительно, с 9 до 24 ч была отмечена тенденция к возрастанию (рис. 1).

 

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД от времени после смерти

Примечание: значения показателей представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего.

 

Анализ изменения средних значений показателя флуоресценции НАДН в зависимости от времени после смерти позволил предположить, что обнаруженная зависимость описывается уравнением Вейбулла (уравнение 1) или логнормальным уравнением (уравнение 2). В результате анализа для построения зависимости было выбрано уравнение 1, так как оно давало большую точность приближения (R ² = 0,77, F(4,109) = 87,4, р < 0,001) по сравнению с уравнением 2 (R ² = 0,70, F(2,109) = 123,3, р < 0,001).

$y=y_0+a\times \frac{{(c-1)}^{{\displaystyle \frac{(1-c)}{c}}}}{c}\times \left|\frac{x-x_0}{b}+\frac{{(c-1)}^{{\left({\displaystyle \frac{1}{c}}\right)}^{(c-1)}}}{c}\right|\times e^{-\left|\frac{x-x_0}{b}+\frac{{(c-1)}^{{{\displaystyle \frac{1}{c}}}^c}}{c}+\frac{\left(c-1\right)}{c}\right|}$, (уравнение 1)

где y — величина показателя НАДН; x — время после смерти, ч; а, b, c, y₀ и x₀ — коэффициенты уравнения регрессии.

$y=y_0+\frac{a}{x}\times e^{-0,5\times {\left(\frac{\ln \left({\displaystyle \frac{x}{x_0}}\right)}{b}\right)}^2}$, (уравнение 2)

где y — величина показателя НАДН; x — время после смерти, ч; а, b, y₀ и x₀ — коэффициенты уравнения регрессии.

Анализ остатков предварительно построенной регрессионной модели на основании уравнения 1 позволил исключить из выборки 4 наблюдения, абсолютные значения которых превышали 3.

По результатам анализа была построена модель, описывающая зависимость флуоресценции НАДН от времени после смерти на основании уравнения 1 (рис. 2).

 

Рис. 2. Математическая модель динамики интенсивности флуоресценции НАДН в первые сутки после смерти

 

Коэффициент детерминации (R ²) полученной регрессионной модели составил 0,85, стандартная ошибка модели — 0,17, то есть полученное уравнение описывало анализируемую зависимость достаточно точно. Оценка статистической значимости полученного уравнения на основании критерия Фишера при эмпирическом значении критерия Фишера F = 146,3 и числах степеней свободы 4 и 105 составила р < 0,001. Таким образом, полученное уравнение было статистически значимым, то есть характеризовало зависимость в генеральной совокупности.

Коэффициенты полученной модели были статистически значимыми по критерию Стьюдента (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты анализа статистической значимости коэффициентов регрессионной модели зависимости флуоресценции НАДН от времени после смерти

Table 1. Results of statistical significance analysis of regression equation coefficients of mathematical models describing the relationship between NADH fluorescence intensity and time after death

Коэффициент	Значение коэффициента	Стандартная ошибка	Значение критерия Стьюдента (t)	Уровень значимости (р)
a	1,27	0,06	21,99	< 0,0001
b	4,53	0,72	6,28	< 0,0001
c	2,81	0,54	5,19	< 0,0001
x0	2,64	0,14	18,69	< 0,0001
y0	0,25	0,02	11,96	< 0,0001

 

Значения интенсивности флуоресценции ФАД мало изменялись в течение всего времени исследования, поэтому подобрать модель не представлялось возможным.

Возрастание отношения коэффициентов флуоресценции НАДН к ФАД (редокс-отношение, РО) было зарегистрировано с 5-й минуты до 3 ч посмертного периода включительно. Начиная с 4,5 до 24 ч наблюдалось постепенное снижение РО (рис. 3).

 

Рис. 3. Зависимость РО от времени после смерти

Примечание: значения показателей представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего.

 

Анализ изменения средних значений показателя РО в зависимости от времени после смерти более точно описывается уравнением 1, где y — величина показателя РО; x — время после смерти, ч; а, b, c, y₀ и x₀ — коэффициенты уравнения регрессии, так как оно давало большую точность приближения (R ² = 0,79, F(4,109) = 97,0, р < 0,001) по сравнению с уравнением 2 (R ² = 0,65, F(2,109) = 101,3, р < 0,001).

Анализ нормированных остатков обнаружил 6 значений, модуль нормированного остатка которых превышал 3. Эти значения были исключены из дальнейшего анализа.

В итоге на основании уравнения 1 была построена модель, описывающая зависимость изменения значений показателя РО от времени после смерти, представленная графически на рис. 4.

 

Рис. 4. Математическая модель динамики РО в первые сутки после смерти

 

Коэффициент детерминации (R ²) полученной регрессионной модели составил 0,86, стандартная ошибка модели — 0,43, то есть полученное уравнение зависимости РО от времени после смерти является достаточно точным. Оценка статистической значимости полученного уравнения на основании критерия Фишера при эмпирическом значении критерия Фишера F = 173,5 и числах степеней свободы 4 и 103 составила р < 0,001. Таким образом, полученное уравнение было статистически значимым, то есть характеризовало зависимость в генеральной совокупности.

Коэффициенты полученной модели были статистически значимыми по критерию Стьюдента (табл. 2).

 

Таблица 2. Результаты анализа статистической значимости коэффициентов регрессионной модели зависимости РО от времени после смерти

Table 2. Results of statistical significance analysis of regression equation coefficients of mathematical models describing the relationship between RR and time after death

Коэффициент	Значение коэффициента	Стандартная ошибка	Значение критерия Стьюдента (t)	Уровень значимости (р)
a	3,41	0,14	23,94	< 0,0001
b	4,87	0,32	15,39	< 0,0001
c	2,08	0,23	9,16	< 0,0001
x0	2,88	0,16	17,52	< 0,0001
y0	0,71	0,06	12,54	< 0,0001

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленная закономерность обусловлена воздействием гипоксии/аноксии на внутриклеточный метаболизм, переходом клеток на анаэробное дыхание в раннем постмортальном периоде. Полученные нами данные не противоречат результатам исследований коферментов НАДН и ФАД при тканевой ишемии. С момента открытия в 1950 году способности к аутофлуоресценции восстановленного НАДН было проведено множество исследований интенсивности аутофлуоресценции кофермента в тканях в условиях кислородного голодания [7–9]. Большинство работ были и остаются экспериментальными и касаются только кратковременной ишемии. В исследовании F. H. Tomlinson было обнаружено, что ишемия мозга сопровождается увеличением флуоресценции NADH на 150% через 15 мин после окклюзии сонной артерии [8]. Horvath и соавт. была изучена динамика лазериндуцированной флуоресценции НАДН и ФАД в тканях миокарда при окклюзии в течение 2 ч ишемии, которая характеризовалась в первые 5 мин быстрым ростом флуоресценции НАДН и медленным спадом до конца исследования, уменьшением аутофлуоресценции ФАД в первые 5 мин, медленным спадом в течение 30 мин, стационарным уровнем в течение 1 ч и медленным подъемом до окончания исследования [10]. Из этого следует, что характер изменений показателей интенсивности флуоресценции НАДН и ФАД, выявленных нами, схож с характером изменений, полученных при исследовании ишемизированного миокарда, но процесс имеет разные темпы. Возможно, это связано с разной устойчивостью различных тканей к гипоксии. Увеличение аутофлуоресценции НАДН легко объясняется накоплением восстановленного НАДН в отсутствии кислорода [11]. Также известно, что на аутофлуоресценцию коферментов влияет их связь с белком: НАДН флуоресцирует в связанной с белком форме, а ФАД — в свободной [11–13]. Исходя из этого можно предположить, что угасание аутофлуоресценции НАДН и тенденция к возрастанию в конце исследования ФАД связаны с распадом связей коферментов с белками в результате аутолитических процессов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования была выявлена закономерность изменения флуоресценции НАДН, РО и описана уравнением, по которому была создана математическая модель. Зависимость НАДН и РО от времени после смерти, характеризуется уравнением Вейбулла:

$y=y_0+a\times \frac{{(c-1)}^{{\displaystyle \frac{(1-c)}{c}}}}{c}\times \left|\frac{x-x_0}{b}+\frac{{(c-1)}^{{\left({\displaystyle \frac{1}{c}}\right)}^{(c-1)}}}{ c}\right|\times e^{-\left|\frac{x-x_0}{b}+\frac{{(c-1)}^{{\left({\displaystyle \frac{1}{с}}\right)}^c}}{с}\right|}$,

где y — величина показателя НАДН или РО; x — время после смерти, ч; а, b, c, y₀ и x₀ — коэффициенты уравнения регрессии. На основании полученных уравнений были построены математические модели. Статистическая значимость моделей НАДН (R ² = 0,85, F(4,105) = 146,3, р < 0,001) и РО (R ² = 0,86, F(4,103) = 173,5, р < 0,001) оказалась высокой. Возможность математического описания наблюдаемых изменений и полученная высокая точность моделей обусловливают дальнейшие перспективы использования исследуемых показателей как маркеров изменения тканевого метаболизма в различные сроки после смерти. Полученные результаты уточняют механизмы внутриклеточных процессов в условиях длительной аноксии, в процессе умирания тканей, а также представляют возможность использования метода флуоресцентной лазериндуцированной спектроскопии для диагностики давности наступления смерти, создают предпосылки для изучения и моделирования процессов, выявленных нами в эксперименте, на трупах людей.

About the authors

Anastasia S. Babkina

Department of Forensic Medicine, Medical Institute, Peoples’ Friendship University of Russia; V.A. Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology

Author for correspondence.
Email: asbabkina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1780-9829

a post-graduate student of the Department of Forensic Medicine of Peoples’ Friendship University, researcher of the Cell Pathology Laboratory at the Critical Conditions of the V. A. Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology

Russian Federation, Moscow

Dmitriy V. Sundukov

Department of Forensic Medicine, Medical Institute, Peoples’ Friendship University of Russia

Email: sundukov.1958@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8173-8944

Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Head of Forensic Medicine Department of Peoples’ Friendship University

Russian Federation, Moscow

Arkady M. Golubev

Department of Forensic Medicine, Medical Institute, Peoples’ Friendship University of Russia; V.A. Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology

Email: arkadygolubev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3165-0378

Dr. Sci. (Med.), Professor at the Department of Forensic Medicine of Peoples’ Friendship University, Head of the Laboratory of Cell Pathology in Critical Conditions of the V. A. Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files