Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Рицин (ricin) – чрезвычайно ядовитое вещество, содержащееся в семенах растения клещевины обыкновенной (Ricinus communis). Клещевина обыкновенная представляет собой кустарник или небольшое дерево, произрастаемое в тропических и умеренных регионах мира (рис.1.). Рицин - два полипептида, которые связанны между собой дисульфидной связью. Механизм действия биомолекулы рицина: цепь-А попадает в цитоплазму и ферментативно инактивирует рибосомы, а цепь-B на поверхности клетки далее связывается с углеводами. Молекулярная масса цепи А составляет 32 кДа, цепи В - 34 кДа. Рицин оказывает прямое цитотоксическое действие за счет ингибирования синтеза белка [1-3].

Токсичность рицина для человека зависит от пути введения его в организм. Смертельная доза для рицина при пероральном введении составляет примерно 0,3 мг/кг. Для животных: средняя ингаляционная летальная доза (LD₅₀) равна 3–5 мкг/кг; средняя пероральная LD₅₀ для животных составляет в среднем 20 мг/кг. При инъекционном пути введения отравление происходит при небольших дозах за счет лучшей биодоступности. У человека смерть может наступить при употреблении семян клещевины в количестве от 4 до 8 штук [4].

Ввиду достаточно простого способа получения рицина, по сравнению с другими токсичными агентами, он может быть использован как в криминальных целях, так и в качестве потенциального инструмента при террористических актах [5, 6].

Однако многие судебно-химические лаборатории не обладают оборудованием и методической базой для проведения исследований на такие биомолекулы, как рицин. В таких случаях возможно определение низкомолекулярных компонентов из клещевины обыкновенной, которые могут быть маркерами для установления факта отравления рицином. Основные вещества-маркеры наличия рицина в организме человека — алкалоид рицинин и рициноловая кислота (таб. 1.).

Семена клещевины обыкновенной содержат около 30-50% масла, известного под названием «касторовое». Это масло содержит до 81-86% специфическую рициноловую (рицинолеиновую) кислоту, которая отсутствует в маслах из других растений. Из одного килограмма семян получается около 0,3-0,5 кг масла и 0,5-0,7 кг касторового жмыха. В семенах клещевины обыкновенной, в основном в их оболочке, может содержаться до 3% рицина, который содержится в оболочке семян. Данная часть растения является самой ядовитой. Все остальные части растения: листья, семена и жмых содержат рицинин [4, 7].

Цель исследования ― разработка методики экспресс-анализа для обнаружения веществ-маркеров при установлении факта отравления рицином в биологических объектах для целей и задач судебно-медицинской экспертизы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

При разработке методики в качестве объекта сравнения готовили экстракт из клещевины обыкновенной с содержанием рицинина и рициноловой кислоты – семена и касторовое масло. Объектом исследования являлись кровь и моча от лиц, предположительно употреблявших компоненты клещевины обыкновенной. Исследование проводили на жидкостном и газовом хромато-масс-спектрометрах.

Пробоподготовка образцов

ВЭЖХ/МС/МС

В пробирки на 1,5 мл типа "Эппендорф" раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе теплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объемом 10 мкл и исследовали.

ГХ/МС/МС

В пробирки на 1,5 мл типа "Эппендорф" раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе теплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл этилацетата. Органическую фазу отбирали объемом 1,0 мкл и исследовали.

Изолирование алкалоидов из касторового масла

Изолирование алкалоидов проводили подкисленной водой. Полученную водную фазу экстрагировали методом жидкость-жидкостной экстракции органическими растворителями. К 1 мл масла добавляли воду, подкисленную щавелевой кислотой до значения pH среды равной 2-3, настаивали в течение 1 часа при периодическом помешивании, встряхивали, центрифугировали. Экстрагирование из водной фазы проводили диэтиловым эфиром. Водную фазу доводили до рН=8-9 путем подщелачивания её раствором аммиака и экстрагировали далее смесью этилацетат-гептан-изопропанол (5:5:1). На фильтр наносили слой безводного сульфата натрия и полученное извлечение фильтровали, затем упаривали досуха в токе теплого воздуха. Сухой остаток разводили в 1000 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объемом 10 мкл и исследовали.

Условия хроматографирования

Условия хроматографирования ВЭЖХ/МС/МС

Анализ проводили на хромато-масс-спектрометре модели Orbitrap Exploris 120 при использовании режима полного сканирования и дальнейшей фрагментации ионов – FullMS-ddMS2, что позволяет обеспечивать регистрацию молекулярного иона вещества и характеристичных фрагментов в диапазоне молекулярных масс от 50 до 750 Да. Аналитическая колонка – Acclaim™ RSLC 120 C18 (2.2 μm, 120 Å, 2.1x100 mm) Dionex Bonded Silica Products (ThermoScientific, США). Термостатирование аналитической колонки – 30ºС. Скорость потока для подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Использовали двухкомпонентную подвижную фазу, где фаза А это 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, а фаза B – 100% ацетонитрил. Для анализа вводили пробу в автоматическом режиме объемом 10 мкл. Параметры градиентного элюирования представлены в таблице 2.

Условия хроматографирования ГХ/МС/МС

Анализ выполняли на хромато-масс-спектрометре с трехквадрупольным масс-селективным детектором Thermo Scientific TQ9000 (QQQ), оснащенным автоматическим отбором образцов и газовым хроматографом TRACE 1310 GC с использованием подобранных параметров (табл. 3).

В вышеописанных условиях хроматографирования время удерживания рицинина составило 3,32 мин, а рицинолевой кислоты ― 14,52 мин. Для рицина Precursor m/z [M+H]+ – (Precursor m/z 165,0659), а для рицинолевой кислоты – Precursor m/z [M-H]- (Precursor m/z 297,2435). Полученные результаты хроматографирования статистически обработаны; относительное стандартное отклонение для рицинина составило 12,0%, для рицинолевой кислоты – 5,1%.

Этическая экспертиза

Исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов, так как исследование проводилось без исследования на людях и животных, а использовались биологические образцы, направленные на исследование.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработанную методику использовали для идентификации веществ-маркеров при употреблении семян клещевины обыкновенной в случаях подозрения на отравление веществами растительного происхождения.

На основании проведенного исследования в экспертных образцах крови и мочи были обнаружены  рицинин и рициноловая кислота. Получены результаты оптимального хроматографического разделения и идентификации рицинина и рициноловой кислоты из крови и мочи, представленные на рисунках 2-4.

Относительное стандартное отклонение времени удерживания рицинина и рицинолевой кислоты в извлечениях из биологических объектов указывают [8, 9], что подобранные условия пробоподготовки и хроматографирования оптимальны для извлечения из биологической матрицы с учетом её влияния.

ОБСУЖДЕНИЕ

Отравления могут быть вызваны не только семенами клещевины, но и кустарно изготовленным касторовым маслом, содержащим высокие концентрации рицинина. Теоретически, одним из этапов производства касторового масла должна быть экстракционная очистка продуктов от токсичных алкалоидов, в том числе рицинина.

Результаты исследования показали (рис. 4.), что во всех образцах касторового масла, полученных из аптечных сетей, был обнаружен токсичный алкалоид рицинин.

Согласно ГОСТу 18102-95 «Масло касторовое медицинское» [10] показатели пищевой и потребительской ценности (органолептические и физико-химические показатели) должны соответствовать требованиям, указанным в таблице №4. Как видно из таблицы №4, содержание в масле рицинина по данному ГОСТу не контролируется и не регламентировано. Для проверки данного предположения мы исследовали несколько образцов касторового масла, продаваемых в аптечной сети.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Разработана схема пробоподготовки и подобраны оптимальные условия изолирования рицинина и рициноловой кислоты из биологических жидкостей с целью дальнейшего проведения исследования современными хроматографическими методами (ВЭЖХ/МС/МС и ГХ/МС/МС).
2. Разработана экспресс-методика обнаружения рицинина и рициноловой кислоты (маркеров наличия рицина) в крови, моче, семенах клещевины и касторовом масле.
3. Методика включает в себя простую и быструю пробоподготовку, для которой требуется всего 200 мкл биологической жидкости и позволяет установить наличие рицина в организме человека.
4. Определены хроматографические и масс-спектрометрические характеристики для последующей идентификации рицинина и рициноловой кислоты при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследованиях.
5. Установлено наличие токсичного рицинина в продуктах переработки семян клещевины обыкновенной, который может быть причинной отравления людей.

Об авторах

Роман Анатольевич Калёкин

Автор, ответственный за переписку.
Email: kalyokin@yandex.ru

Самвел Сережаевич Барсегян

Email: himija@rc-sme.ru

Алла Андреевна Волкова

Email: himija@rc-sme.ru

Алевтина Михайловна Орлова

Email: himija@rc-sme.ru

Список литературы

Дополнительные файлы