Determination of markers of lifetime use of substances containing ricin



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND: The problem of establishing the fact of acute and lethal poisoning with cytotoxic substances currently remains an urgent task for forensic medical examination. Ricin belongs to this group of substances and is the most toxic representative, which can have irreversible health consequences if ingested into the human body.

AIM: development of a rapid analysis technique for detecting marker substances when establishing the fact of ricin poisoning in biological objects for the purposes and tasks of forensic medical examination.

MATERIALS AND METHODS: We have described optimal conditions for isolating ricinin and ricinolic acid, as markers of the presence of ricin, from blood and urine for further investigation by modern chromatographic methods (HPLC/MS/MS and GC/MS/MS).

RESULTS: According to the results of the study, an express method for the detection of ricinin and ricinoleic acid in biological fluids, castor oil and castor seeds has been developed, which requires only 200 μl of biological fluid. Chromatographic and mass spectrometric characteristics were determined for the subsequent identification of ricinin and ricinolic acid. The authors have established the presence of toxic ricinin in the products of processing of castor seeds, which can be a causal cause of poisoning of people.

CONCLUSION: For the first time, an express technique of forensic chemical and chemical-toxicological examination of ricin poisoning by chromatographic methods - HPLC/MS/MS and GC/MS/MS, based on the determination of marker substances in biological objects ― ricinin and ricinolic acid, is presented.

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Рицин (ricin) – чрезвычайно ядовитое вещество, содержащееся в семенах растения клещевины обыкновенной (Ricinus communis). Клещевина обыкновенная представляет собой кустарник или небольшое дерево, произрастаемое в тропических и умеренных регионах мира (рис.1.). Рицин - два полипептида, которые связанны между собой дисульфидной связью. Механизм действия биомолекулы рицина: цепь-А попадает в цитоплазму и ферментативно инактивирует рибосомы, а цепь-B на поверхности клетки далее связывается с углеводами. Молекулярная масса цепи А составляет 32 кДа, цепи В - 34 кДа. Рицин оказывает прямое цитотоксическое действие за счет ингибирования синтеза белка [1-3].

Токсичность рицина для человека зависит от пути введения его в организм. Смертельная доза для рицина при пероральном введении составляет примерно 0,3 мг/кг. Для животных: средняя ингаляционная летальная доза (LD50) равна 3–5 мкг/кг; средняя пероральная LD50 для животных составляет в среднем 20 мг/кг. При инъекционном пути введения отравление происходит при небольших дозах за счет лучшей биодоступности. У человека смерть может наступить при употреблении семян клещевины в количестве от 4 до 8 штук [4].

Ввиду достаточно простого способа получения рицина, по сравнению с другими токсичными агентами, он может быть использован как в криминальных целях, так и в качестве потенциального инструмента при террористических актах [5, 6].

Однако многие судебно-химические лаборатории не обладают оборудованием и методической базой для проведения исследований на такие биомолекулы, как рицин. В таких случаях возможно определение низкомолекулярных компонентов из клещевины обыкновенной, которые могут быть маркерами для установления факта отравления рицином. Основные вещества-маркеры наличия рицина в организме человека — алкалоид рицинин и рициноловая кислота (таб. 1.).

Семена клещевины обыкновенной содержат около 30-50% масла, известного под названием «касторовое». Это масло содержит до 81-86% специфическую рициноловую (рицинолеиновую) кислоту, которая отсутствует в маслах из других растений. Из одного килограмма семян получается около 0,3-0,5 кг масла и 0,5-0,7 кг касторового жмыха. В семенах клещевины обыкновенной, в основном в их оболочке, может содержаться до 3% рицина, который содержится в оболочке семян. Данная часть растения является самой ядовитой. Все остальные части растения: листья, семена и жмых содержат рицинин [4, 7].

Цель исследования ― разработка методики экспресс-анализа для обнаружения веществ-маркеров при установлении факта отравления рицином в биологических объектах для целей и задач судебно-медицинской экспертизы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

При разработке методики в качестве объекта сравнения готовили экстракт из клещевины обыкновенной с содержанием рицинина и рициноловой кислоты – семена и касторовое масло. Объектом исследования являлись кровь и моча от лиц, предположительно употреблявших компоненты клещевины обыкновенной. Исследование проводили на жидкостном и газовом хромато-масс-спектрометрах.

Пробоподготовка образцов

ВЭЖХ/МС/МС

В пробирки на 1,5 мл типа "Эппендорф" раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе теплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объемом 10 мкл и исследовали.

ГХ/МС/МС

В пробирки на 1,5 мл типа "Эппендорф" раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе теплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл этилацетата. Органическую фазу отбирали объемом 1,0 мкл и исследовали.

Изолирование алкалоидов из касторового масла

Изолирование алкалоидов проводили подкисленной водой. Полученную водную фазу экстрагировали методом жидкость-жидкостной экстракции органическими растворителями. К 1 мл масла добавляли воду, подкисленную щавелевой кислотой до значения pH среды равной 2-3, настаивали в течение 1 часа при периодическом помешивании, встряхивали, центрифугировали. Экстрагирование из водной фазы проводили диэтиловым эфиром. Водную фазу доводили до рН=8-9 путем подщелачивания её раствором аммиака и экстрагировали далее смесью этилацетат-гептан-изопропанол (5:5:1). На фильтр наносили слой безводного сульфата натрия и полученное извлечение фильтровали, затем упаривали досуха в токе теплого воздуха. Сухой остаток разводили в 1000 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объемом 10 мкл и исследовали.

Условия хроматографирования

Условия хроматографирования ВЭЖХ/МС/МС

Анализ проводили на хромато-масс-спектрометре модели Orbitrap Exploris 120 при использовании режима полного сканирования и дальнейшей фрагментации ионов – FullMS-ddMS2, что позволяет обеспечивать регистрацию молекулярного иона вещества и характеристичных фрагментов в диапазоне молекулярных масс от 50 до 750 Да. Аналитическая колонка – Acclaim™ RSLC 120 C18 (2.2 μm, 120 Å, 2.1x100 mm) Dionex Bonded Silica Products (ThermoScientific, США). Термостатирование аналитической колонки – 30ºС. Скорость потока для подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Использовали двухкомпонентную подвижную фазу, где фаза А это 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, а фаза B – 100% ацетонитрил. Для анализа вводили пробу в автоматическом режиме объемом 10 мкл. Параметры градиентного элюирования представлены в таблице 2.

Условия хроматографирования ГХ/МС/МС

Анализ выполняли на хромато-масс-спектрометре с трехквадрупольным масс-селективным детектором Thermo Scientific TQ9000 (QQQ), оснащенным автоматическим отбором образцов и газовым хроматографом TRACE 1310 GC с использованием подобранных параметров (табл. 3).

В вышеописанных условиях хроматографирования время удерживания рицинина составило 3,32 мин, а рицинолевой кислоты ― 14,52 мин. Для рицина Precursor m/z [M+H]+ – (Precursor m/z 165,0659), а для рицинолевой кислоты – Precursor m/z [M-H]- (Precursor m/z 297,2435). Полученные результаты хроматографирования статистически обработаны; относительное стандартное отклонение для рицинина составило 12,0%, для рицинолевой кислоты – 5,1%.

Этическая экспертиза

Исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов, так как исследование проводилось без исследования на людях и животных, а использовались биологические образцы, направленные на исследование.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработанную методику использовали для идентификации веществ-маркеров при употреблении семян клещевины обыкновенной в случаях подозрения на отравление веществами растительного происхождения.

На основании проведенного исследования в экспертных образцах крови и мочи были обнаружены  рицинин и рициноловая кислота. Получены результаты оптимального хроматографического разделения и идентификации рицинина и рициноловой кислоты из крови и мочи, представленные на рисунках 2-4.

Относительное стандартное отклонение времени удерживания рицинина и рицинолевой кислоты в извлечениях из биологических объектов указывают [8, 9], что подобранные условия пробоподготовки и хроматографирования оптимальны для извлечения из биологической матрицы с учетом её влияния.

ОБСУЖДЕНИЕ

Отравления могут быть вызваны не только семенами клещевины, но и кустарно изготовленным касторовым маслом, содержащим высокие концентрации рицинина. Теоретически, одним из этапов производства касторового масла должна быть экстракционная очистка продуктов от токсичных алкалоидов, в том числе рицинина.

Результаты исследования показали (рис. 4.), что во всех образцах касторового масла, полученных из аптечных сетей, был обнаружен токсичный алкалоид рицинин.

Согласно ГОСТу 18102-95 «Масло касторовое медицинское» [10] показатели пищевой и потребительской ценности (органолептические и физико-химические показатели) должны соответствовать требованиям, указанным в таблице №4. Как видно из таблицы №4, содержание в масле рицинина по данному ГОСТу не контролируется и не регламентировано. Для проверки данного предположения мы исследовали несколько образцов касторового масла, продаваемых в аптечной сети.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

  1. Разработана схема пробоподготовки и подобраны оптимальные условия изолирования рицинина и рициноловой кислоты из биологических жидкостей с целью дальнейшего проведения исследования современными хроматографическими методами (ВЭЖХ/МС/МС и ГХ/МС/МС).
  2. Разработана экспресс-методика обнаружения рицинина и рициноловой кислоты (маркеров наличия рицина) в крови, моче, семенах клещевины и касторовом масле.
  3. Методика включает в себя простую и быструю пробоподготовку, для которой требуется всего 200 мкл биологической жидкости и позволяет установить наличие рицина в организме человека.
  4. Определены хроматографические и масс-спектрометрические характеристики для последующей идентификации рицинина и рициноловой кислоты при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследованиях.
  5. Установлено наличие токсичного рицинина в продуктах переработки семян клещевины обыкновенной, который может быть причинной отравления людей.
×

References

  1. Savochenko A.I., Filkova K.I. The effect of ricin on the body // Proceedings of the Russian Military Medical Academy. 2018. V. 37. No. 1 S1-2. pp. 187-190.
  2. Chepur S.V., Al-Shekhadat R.I., Gogolevsky A.S., Pugach V.A., Myasnikov V.A., Anisenkova E.V., Levchuk E.V., Tyunin M.A. . Molecular aspects of ricin cytotoxicity // Medline.ru. Russian biomedical journal. 2021. V. 22. S. 271-292.
  3. Kalekin R.A., Volkova A.A., Orlova A.M., Akimova V.D., Barseghyan S.S. Forensic-chemical and chemical-toxicological study by HPLC-MS/MS in ricin poisoning. Forensic-medical examination. 2023;66(3):34–39. https://doi.org/10.17116/sudmed20236603134
  4. Fundamentals of phytotoxicology. Overview of plant objects. Elements of phytochemical analysis : textbook / EG Privalova VI Mirovich ; FGBOU VO IGMU of the Ministry of Health of Russia, Department of Pharmacognosy and Pharmaceutical Technology. - Irkutsk: IGMU, 2018 - 102 p.
  5. O. M. Arstamyan, V. S. Tkachishin, and A. Yu. Modern poisonous substances as a terrorist threat to society // Emergency Medicine. 2016. No. 2 (73). pp. 11-20.
  6. Melnichenko O.G. Ricin as a possible bioterrorist weapon and its impact on the cardiovascular system // Student Bulletin. 2022. No. 10-3 (202). pp. 24-25.
  7. Odinets S.I. Biometric analysis of cotyledon leaves of castor seedlings // Scientific and Technical Bulletin of the Institute of Oilseeds of the National Academy of Sciences. 2018. No. 26. S. 60-71.
  8. Volkova A.A., Kalekin R.A., Orlova A.M. Detection of clobazam and its metabolite in urine by high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection in case of poisoning. Forensic medicine. 2022. V. 8. No. 4. S. 47-55. https://doi.org/10.17816/fm705
  9. Kalekin R.A., Moskaleva N.E., Volkova A.A., Orlova A.M., Markin P.A., Nevmyatova S.R., Appolonova S.A. Determination of zaleplon and clobazam by high performance liquid chromatography - high resolution tandem mass spectrometry using Orbitrap technology // Forensic medical examination. 2022. V. 65. No. 2. S. 24-28.
  10. GOST 18102-95 Interstate standard medical castor oil. Specifications. Castor oil for medical purposes. specifications. Introduction date 1997-01-01

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 60835 выдано 09.09.2021 г. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 – 59181 выдано 03.09.2014 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies