Identification of markers of ricin-containing object consumption in blood and urine

Full Text

Обоснование

Рицин (ricin) — чрезвычайно ядовитое вещество, содержащееся в семенах растения клещевины обыкновенной (Ricinus communis). Клещевина обыкновенная представляет собой кустарник или небольшое дерево, произрастающее в регионах мира с тропическим и умеренным климатом (рис. 1).

 

Рис. 1. Клещевина обыкновенная (a) и семена клещевины (b).

Fig. 1. Castor is a shrub (a) and seeds (b).

 

Рицин представляет собой два полипептида, которые связаны между собой дисульфидной связью. Механизм действия биомолекулы рицина: А-цепь попадает в цитоплазму и ферментативно инактивирует рибосомы, а B-цепь на поверхности клетки далее связывается с углеводами. Молекулярная масса цепи А составляет 32 кДа, цепи В — 34 кДа. Рицин оказывает прямое цитотоксическое действие за счёт ингибирования синтеза белка [1–3].

Токсичность рицина для человека зависит от пути введения его в организм. Смертельная доза для рицина при пероральном введении составляет примерно 0,3 мг/кг. Для животных средняя ингаляционная летальная доза (lethal dose, LD₅₀) равна 3–5 мкг/кг, средняя пероральная LD₅₀ составляет в среднем 20 мг/кг. При инъекционном пути введения отравление происходит при небольших дозах за счёт лучшей биодоступности. Для человека смертельная доза при употреблении семян клещевины может составить от 4 до 8 штук [4].

Ввиду достаточно простого способа выделения рицина из семян клещевины, по сравнению с другими токсичными веществами растительного происхождения, или синтеза он может быть использован в криминальных целях, в том числе в качестве потенциального инструмента при террористических актах [5, 6]. Однако многие судебно-химические лаборатории не проводят исследований на такие биомолекулы, как рицин. В таких случаях возможно определение низкомолекулярных компонентов из клещевины обыкновенной, которые могут быть маркёром для установления факта отравления рицином. Основные вещества-маркеры наличия рицина в организме человека — алкалоид рицинин и рицинолевая кислота (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристики веществ-маркеров рицина

Table 1. Characteristics of Ricin marker substances

Вещество-маркер	Структурная формула	Химическая формула	Моноизотопная масса
Рицинин		C8H8O2N2	164.0585
Рицинолевая кислота		C18H34O3	298.2507

 

Семена клещевины обыкновенной содержат около 30–50% масла, известного под названием «касторовое». Это масло содержит до 81–86% специфической рицинолевой (рицинолеиновой) кислоты, которая отсутствует в маслах из других растений. Из одного килограмма семян получается около 0,3–0,5 кг масла и 0,5–0,7 кг кас-торового жмыха. В семенах клещевины обыкновенной, в основном в их оболочке, может содержаться до 3% рицина. Эта часть растения является самой ядовитой. Все остальные части растения (листья, семена и жмых) содержат рицинин [4, 7].

Цель исследования — предложить методику экспресс-анализа для обнаружения веществ-маркеров при установлении факта отравления рицином в биологических объектах при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании.

Материалы и методы

Объектом сравнения был экстракт из клещевины обыкновенной (семена и касторовое масло) с содержанием рицинина и рицинолевой кислоты. Объектом исследования являлись кровь и моча от лиц, предположительно употребивших семена клещевины обыкновенной или касторовое масло. Исследование проводили на жидкостном и газовом хромато-масс-спектрометрах.

В объектах сравнения (экстракты из семян и касторового масла) были идентифицированы методом масс-спектрометрии рицинин и рицинолевая кислота по библиотечным данным масс-спектров, которые являлись рабочими стандартными образцами ввиду отсутствия в доступе для судебно-химических и химико-токсикологических подразделений стандартов этих веществ.

Пробоподготовка образцов

Пробоподготовку проводили по оптимизированной методике [3].

Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС/МС). В пробирки на 1,5 мл типа Эппендорф раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе тёплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объёмом 10 мкл и исследовали.

Газовая хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ГХ/МС/МС). В пробирки на 1,5 мл типа Эппендорф раздельно вносили по 200 мкл крови и мочи, затем вносили по 600 мкл метанола, далее встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали, извлечение упаривали в токе тёплого воздуха. Полученный сухой остаток разводили в 200 мкл этилацетата. Органическую фазу отбирали объёмом 10 мкл и исследовали.

Изолирование алкалоидов из касторового масла. Изолирование алкалоидов проводили подкисленной водой. Полученную водную фазу экстрагировали методом жидкость-жидкостной экстракции органическими растворителями. К 1 мл масла добавляли воду, подкисленную щавелевой кислотой, до значения pH среды равной 2–3, настаивали в течение 1 часа при периодическом помешивании, встряхивали, центрифугировали. Экстрагирование из водной фазы проводили диэтиловым эфиром. Водную фазу доводили до рН 8–9 путём подщелачивания её раствором аммиака и экстрагировали далее смесью этилацетат-гептан-изопропанол (5:5:1). На фильтр наносили слой безводного сульфата натрия, и полученное извлечение фильтровали, затем упаривали досуха в токе тёплого воздуха. Сухой остаток разводили в 1000 мкл смеси 0,1% раствора муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила. Органическую фазу отбирали объёмом 10 мкл и исследовали.

Условия хроматографирования

Условия хроматографирования ВЭЖХ/МС/МС. Анализ проводили по оптимизированной методике [3] на хромато-масс-спектрометре модели Orbitrap Exploris 120 при использовании режима полного сканирования и дальнейшей фрагментации ионов — FullMS-ddMS2, что позволяет обеспечивать регистрацию молекулярного иона вещества и характеристичных фрагментов в диапазоне молекулярных масс от 50 до 750 Да. Аналитическая колонка — Acclaim™ RSLC 120 C18 (2.2 μm, 120 Å, 2.1×100 mm) Dionex Bonded Silica Products (Thermo Scientific, США). Термостатирование аналитической колонки — 30ºС. Скорость потока для подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Использовали двухкомпонентную подвижную фазу, где фаза А — 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, а фаза B — 100% ацетонитрил (для ВЭЖХ). Для анализа вводили пробу в автоматическом режиме объёмом 10 мкл. Параметры градиентного элюирования представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Программа градиентного элюирования

Table 2. Gradient Elution program

Время, мин	Фаза А, %	Фаза В, %
0	99	1
1	99	1
4	79	21
8	71	29
13	36	64
15	1	99
17,1	1	99
17,3	99	1
19	99	1

 

Условия хроматографирования ГХ/МС/МС. Анализ выполняли на хромато-масс-спектрометре с трёхквадрупольным масс-селективным детектором Thermo Scientific TQ9000, оснащённым автоматическим отбором образцов и газовым хроматографом TRACE 1310 GC, с использованием параметров и подобранного градиентного повышения температуры (табл. 3).

 

Таблица 3. Параметры хроматографирования методом газовой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Table 3. Parameters gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry Chromatography

Аналитическая колонка				Agilent HP 5-MS (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм)
МС/МС режим
Газ. носитель (Carrier gas)				Гелий
Режим (Mode)				Неразделённый (Splitless)
Время без разделения (Splitless time)				0,90 мин
Расход при разделении (Split flow)				50,0 мл/мин
Программа градиентного повышения температуры
№	Температура, °С/мин	Температура, °С	Время, мин
0	-	50	3,00
1	10,0	310	12,00
Параметры работы источника ионизации
Тип ионизации		Электрораспыление
Температура линии передачи в МС (MS transfer line temp)		200°С
Температура источника ионов (Ion source temp)		200°С
Поток газа в режиме ХИ (CI gas flow)		1,00 мл/мин

 

В вышеописанных условиях хроматографирования время удерживания рицинина составило 3,32 мин, а рицинолевой кислоты — 14,52 мин. Для рицина — Precursor m/z [M+H]+ (Precursor m/z 165,0659), а для рицинолевой кислоты — Precursor m/z [M-H]- (Precursor m/z 297,2435). Полученные результаты хроматографирования статистически обработаны (n=6); относительное стандартное отклонение для рицинина составило 12,0%, для рицинолевой кислоты — 5,1%.

Результаты

Предложенные методы использовали для идентификации веществ-маркеров при употреблении семян клещевины обыкновенной в случаях подозрения на отравление веществами растительного происхождения.

На основании проведённого исследования в экспертных образцах крови и мочи были обнаружены рицинин и рицинолевая кислота. Полученные результаты хроматографического разделения и идентификации рицинина и рицинолевой кислоты из крови и мочи представлены на рис. 2–5.

 

Рис. 2. Фрагмент хроматограммы и спектрограмма рицинолевой кислоты (а) и рицинина (b) в извлечении из крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Fig. 2. Chromatogram fragment and spectrogram of ricinolic acid (a) and ricinin (b) in blood extraction by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.

 

Рис. 3. Фрагмент хроматограммы и спектрограмма рицинолевой кислоты (а) и рицинина (b) в извлечении из мочи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Fig. 3. Fragment of chromatogram and spectrogram of ricinolic acid (a) and ricinin (b) in urine extraction by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.

 

Рис. 4. Хроматограмма и МС/МС-спектрограмма рицинина в извлечении из касторового масла методом газовой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Fig. 4. Chromatogram and MS/MS spectrogram of ricinin in castor oil extraction by gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry.

 

Рис. 5. Фрагмент хроматограммы и спектрограмма рицинина в извлечении из мочи методом газовой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Fig. 5. Fragment of chromatogram and spectrogram of ricinin from urine extraction by gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry.

 

Относительное стандартное отклонение времени удерживания рицинина и рицинолевой кислоты в извлечениях из биологических объектов указано в работах отечественных авторов [8, 9], где сообщается, что подобранные условия пробоподготовки и хроматографирования позволяют идентифицировать рицинин и рицинолевую кислоту в извлечениях из биологической матрицы с учётом её влияния.

Обсуждение

Отравления могут быть вызваны не только семенами клещевины, но и кустарно изготовленным касторовым маслом, содержащим высокие концентрации рицинина. Одним из этапов производства касторового масла должна быть экстракционная очистка продуктов от токсичных алкалоидов, в том числе рицинина.

Согласно ГОСТу 18102-95¹, показатели пищевой и потребительской ценности (органолептические и физико-химические показатели) должны соответствовать требованиям, указанным в табл. 4. Как видно из табл. 4, содержание в масле рицинина по данному ГОСТу не контролируется и не регламентировано. Для проверки данного предположения мы исследовали несколько образцов кас-торового масла, продаваемых в аптечной сети. Результаты исследования показали (см. рис. 4), что во всех образцах касторового масла, полученных из аптечных сетей, обнаружен токсичный алкалоид рицинин.

Заключение

Разработаны методика пробоподготовки и установлены оптимальные условия изолирования рицинина и рицинолевой кислоты из биологических жидкостей, а также методика пробоподготовки касторового масла с целью дальнейшего проведения исследования современными хроматографическими методами (ВЭЖХ/МС/МС и ГХ/МС/МС). Методы включают в себя простую и быструю пробоподготовку, для которой требуется всего 200 мкл биологической жидкости, и позволяют установить наличие маркеров рицина в организме человека.

Разработана экспресс-методика обнаружения рицинина и рицинолевой кислоты (маркеров наличия рицина) в крови, моче, семенах клещевины и касторовом масле.

Определены хроматографические и масс-спектрометрические характеристики (время удерживания и масс-спектры) для последующей идентификации рицинина и рицинолевой кислоты при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследованиях.

В продуктах переработки семян клещевины обыкновенной установлено наличие токсичного рицинина, который может быть причиной отравления людей.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: С.С. Барсегян, Р.А. Калёкин, А.А. Волкова, А.М. Орлова — сбор данных, написание текста рукописи, научное редактирование текста рукописи, рассмотрение и одобрение окончательного варианта рукописи.

Additional information

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. S.S. Barsegyan, A.A. Volkova, R.A. Kalekin, A.M. Orlova — data collection, writing the text of the manuscript, critical revition of the manuscript, editing and approve the final manuscript.

 

¹ ГОСТ 18102-95. Группа Р11. Межгосударственный стандарт. Масло касторовое медицинское. Технические условия. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/1200022096.

About the authors

Samvel S. Barsegyan

Russian Centre of Forensic Medical Expertise

Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0001-6234-4253
SPIN-code: 1261-1536

Cand. Sci. (Pharmacy)

Россия, Moscow

Roman A. Kalekin

Russian Centre of Forensic Medical Expertise; Peoples' Friendship University of Russia

Author for correspondence.
Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-4989-3511
SPIN-code: 2473-7421

Dr. Sci. (Pharmacy)

Россия, Moscow; Moscow

Alla A. Volkova

Russian Centre of Forensic Medical Expertise; Peoples' Friendship University of Russia

Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-9882-2330

Cand. Sci. (Pharmacy)

Россия, Moscow; Moscow

Alevtina M. Orlova

Russian Centre of Forensic Medical Expertise

Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-5419-1418
SPIN-code: 7685-2315

Cand. Sci. (Pharmacy)

Россия, Moscow

References

Supplementary files