IMMUNOHISTOCHEMISTRY METHOD IN FORENSIC MEDICINE: A SCIENTIFIC REVIEW

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Особенности патогенеза и процесса повреждения в том, что происходящие в организме ответные реакции в момент нарушения целостности и травматизации тканей являются последствием любого травматического воздействия, сопровождающегося изменением метаболизма и жизненного цикла клетки, её гибелью, некробиозом и некрозом тканей. Это в свою очередь приводит к локальным сбоям в работе иммунной системы, нарушениям в работе гемомикроциркуляторного русла и последовательностью высвобождения биологически активных медиаторов воспаления.

Достоверное и точное установление прижизненности и давности механических повреждений является одной из ключевых задач современной судебной медицины. Исследователям всегда казалось недостаточным владеть только макроскопическими признаками того или иного повреждения. С течением времени и научно-практических достижений, наиболее часто применяемый и широко используемом, стал микроскопический/гистологический метод исследования. Со временем и прогрессом в области микроскопии, разработки новых методик и техник, к нему присоединился – гистохимический метод. В настоящее время уровень медицинских технологий позволяет ещё глубже исследовать эти вопросы благодаря появлению иммуногистохимического метода (далее – ИГХ). Применение ИГХ, как передового метода, в случаях неочевидности и неоднозначности процессов, происходящих в повреждённых тканях, может стать ключевым инструментом в определении прижизненности и давности повреждений, значительно превосходя традиционные подходы.

Применение ИГХ-метода исследования в клинической практике стало обыденным и рутинным, и уже невозможно представить себе исследования в области онкоморфологии. Кроме этого, его успешно применяют и специалисты в области инфекционных болезней, а также специалисты в области гематологии. Но при этом в судебной медицине, а именно: танатологии и гистологии, не нашло настолько широкого применения. Изучение прижизненности и давности повреждений с применением ИГХ-маркеров стало актуальным направлением, предвещающим устранение существующего пробела, особенно учитывая, что эта проблема продолжает оставаться важной в практической деятельности эксперта. В алгоритм изучения морфологических изменений, происходящий с течением времени в повреждённых тканях, необходимо включать этапы исследования, которые позволят сформулировать точное танатогенетическое суждение в подобных случаях.

ИСТОРИЯ ЗАРОЖДЕНИЯ МЕТОДА ИГХ

Методы иммуногистохимии начали развиваться в 30-е годы ХХ века, когда впервые были получены антитела с красителем, реагирующие с антигенами. В 40-х годах группой учёных под руководством патологоанатома и иммунолога Альберта Кунса были получены флуоресцентно меченные антитела, что позволило разработать технику иммунофлуоресценции [3, 38, 40].

Со временем иммуногистохимический анализ развивался и претерпевал изменения как в проведении, так и в спектре использования [36]. Стоит отметить, что при развитии иммуногистохимических реакций появилась классификация: применение моноклональных и поликлональных антител. В 1975 году иммунологами Жоржем Кёлером и Сесаром Мильштейном были открыты моноклональные антитела – антитела, принадлежащие к одному клеточному клону, связывающиеся только с одним участком антигена. Применение моноклональных антител при проведении иммуногистохимического анализа обеспечивает слабое иммуноокрашивание на срезах. После появились поликлональные антитела. Они имеют большее преимущество по сравнению с моноклональными: первые обеспечивают крупные нерастворимые и ярко окрашивающиеся комплексы, также поликлональные антитела остаются стабильными в различных средах независимо от pH и концентраций веществ, что позволяет им быть более актуальными при проведении иммуногистохимического анализа [3, 12, 24].

Одна из классификаций ИГХ-матода: прямой (подходит для обнаружения высокоэкспрессированных антигенов) и непрямой метод (при исследовании слабо экспрессируемых антигенов, которые выигрывают от усиления сигнала, обеспечиваемого вторичным реагентом).

С момента первого использования иммуногистохимии методология её была значительно усовершенствована, что привело к широкому использованию этого метода [12, 35, 48]. Иммуногистохимия остаётся ведущим инструментом в области клинической медицины. Патоморфологической диагностики в целом. И в общем, успешно внедряется в смежные науки и судебно-медицинскую практику.

С 20 века иммуногистохимический метод исследования широко применяется в онкоморфологии. Применим для специфической визуализации разнообразных и трудно диагностируемых процессов в тканях. Именно иммуноогистохимию чаще всего используют для дифференцировки злокачественной и доброкачественной новообразований [41]. Однако следует помнить о том, не всегда можно оперировать результатом иммуногистохимического исследования при дифференциальной диагностике. Ни одно антитело не является полностью чувствительным и специфичным для конкретной опухоли [3, 33, 35, 39, 48].

Развитие метода иммуногистохимии в судебной медицине произошло несколько позже – в середине 1990-ых годов. С тех пор было обнаружено несколько десятков маркёров, позволяющих подтвердить, либо опровергнуть наличие изменений в предполагаемо повреждённых тканях. Большее значение имеют те маркёры, которые делают возможность понимания о существовании повреждения, с первых минут. А также тех, что дают понимания о существование повреждения и по прошествии времени, не взирая на различные условия окружающей среды.

С первого применения иммуногистохимии с целью определения прижизненности и давности травмы вплоть до настоящего времени в судебной медицине произошло немало открытий, связанных с данным методом [9, 10, 25]. Однако уже сейчас благодаря иммуногистохимии возможно точное определение времени повреждения даже спустя несколько суток после смерти. Ранние секреторные, экссудативные и репаративные процессы в зоне повреждения позволяют принципиально решать вопросы прижизненности травмы, а поздние – переживаемости и давности [21, 23, 32].

ПРИОРИТЕТНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИГХ-метода в СУДЕБНОЙ МЕДИЦИНЕ:

1. Применение ИГХ-метода позволяет с наибольшей вероятностью установить время получения травмы путём выявления специфических маркеров воспаления, а затем и заживления в тканях.
2. ИГХ-метод используется для точного типирования состава клеток в повреждённых тканей, что облегчает диагностику разнообразных состояний и причин смерти.
3. ИГХ-метод позволяет выявить заболевания или патологические процессы, которые могли способствовать смерти, но не проявлялись внешними признаками.
4. ИГХ-метод помогает различать изменения, произошедшие прижизненно, от тех, которые возникли в постмортальном периоде, что критично для правильной интерпретации обстоятельств преступления.
5. ИГХ-метод используется для выявления микроскопических повреждений тканей, которые могут указывать на наличие насилия, даже если внешние признаки отсутствуют.
6. В случае смерти от онкологических заболеваний ИГХ-метод помогает детально изучить тип опухоли, её агрессивность и возможные метастазы, что может быть важно для судебного анализа.

Де Маттейс и соавт. оценили использование тропонина I-быстрых скелетных мышц (TNNI2) для проведения дифференциальной диагностики жизнеспособности при самоубийстве через повешение и имитации повешения [18, 34].  

Также имеются обнадёживающие предварительные результаты по выявлению антигена TGβ1 в области прижизненных повреждений кожи в случаях тупой механической травмы [16]. Изучена экспрессия фибронектина, CD62p и фактора VIII при кровотечении из ран [46]. Также давность повреждения оценивалась с использованием маркёров CD14, CD32B и CD68, экспрессируемых на воспалительных клетках [47]. Изучена экспрессия циклооксигеназы-2 в повреждённых тканях [31].  Проводили исследования биоптатов кожи из области повреждения взятых у живых лиц при их освидетельствовании. Исследовали коллаген III, коллаген IV и α-SMA (внутриклеточный матрикс) [29, 20], маркёров воспалительных клеток (MPO, CD45 и CD68) и медиаторы воспаления (MIP-1, IL-8, CML и витронектин) [28], показали хорошие результаты. Проведено ещё не один десяток исследований на повреждённой коже с применением различных маркёров и их комбинаций, показывающие неплохие результаты в определении давности формирования повреждения [42]. Полный обзор литературы и структурированный анализ по проблеме определения давности повреждений кожи с применений методов иммуногистохимии и иммунофлюолисценции провели Tomassini L et al. [43].

Перспективным является изучение патоморфологических изменений в зонах повреждений головного мозга и совершенствование дифференциальной диагностики травматических повреждений ткани мозга с иными видами смерти [7, 11, 45].  Лесникова и соавт. опубликовали единственное исследование, в результате которого оценивалась экспрессия различных маркеров (KL1, анти-CD45, анти-виментина и анти-S100) в нескольких тканях оценивалась одновременно. Был обнаружен положительный результат во всех тканях до 3 суток посмертного интервала [23, 41, 43]. Исследование повреждённых аксонов при ЧМТ определили ранний маркёр, это - β-АРР белок. Выявив при этом достоверные информативные иммуногистохимические критерии аксонального повреждения в различные периоды выживания после получения ЧМТ [18].

1. Dressler и соавт. выявили различие в экспрессии CAMs в повреждённых тканях кожи, в различные сроки постмортального периода [27, 37]. Успешным примером использования методов ИГХ является установление изменение во времени экспрессии различных типов коллагенов, что имеет значение в определении давности образования рубцов [2]. Исследование Р-селектина, обозначили его как маркёр ранней прижизненной реакции в повреждённых мягких тканях [17]. Исследование экспрессии фибриногена и виментина в огнестрельных ранах показали значимые результаты и дали возможность определить зоны повреждения в раневом канале [4, 6, 8]. Полученные в результате иммуногистохимического исследования данные о морфологии незрелых клеток костного мозга в травматических кровоизлияниях области межреберья при переломах рёбер, позволяют убедительно дифференцировать реактивный посттравматический процесс в этой области для оценки времени переживаемости травмы [15].

Изучение антител к сократительным филаментам, таких как актин, миозин и тропонин [5], комбинированное изучение метаболитических маркёров острого ишемического повреждения миокарда [22, 26, 30], изменений при внезапной сердечной смерти [29] позволили значительно продвинуться в области судебно-медицинской кардиоморфологии. Сравнительная оценка изменений в повреждённом миокарде, в посстравматический период при колото-резанном и огнестрельном ранении с использованием C5b-9 и сердечного тропонина C [19].

Инновационные исследования комбинации маркёров анти-CD31 и антицитокератины AE1/AE3 позволяют достоверно оценить эмболию амниотической жидкостью [44].

Как мы видим, исследований с применений различных маркеров их комбинациий приходится на изучение прижизненности и давности повреждений. Спектр исследуемых иммуногистохимических маркеров весьма обширен. Использование одного из них значительно увеличивает вероятность получения противоречивых результатов. Тогда как их комбинация значительно повышает точность и надёжность полученных данных [14].

ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИГХ-метода

Благодаря ИГХ-методу исследования возможно определение давности травмы спустя несколько недель после смерти вплоть до развития запущенных гнилостных процессов; потенциально способен различать прижизненные и посмертные повреждения; позволяет обнаружить изменения на самых ранних этапах острого воспалительного ответа на повреждение [1, 3, 12, 13].

1. Высокая специфичность и чувствительность: ИГХ-метод позволяет точечно определять присутствие и локализацию конкретных белков в тканях, что делает его особенно полезным для детализированного анализа.
2. Диагностическая точность: Использование различных маркеров позволяет более точно диагностировать различные заболевания, включая опухоли и инфекционные процессы.
3. Прогностическая ценность: Определение уровня экспрессии определённых белков может помочь прогнозировать течение болезни и оценить ответ на терапию.
4. Возможность количественного анализа: С помощью ИГХ можно не только качественно, но и количественно оценивать экспрессию маркеров, что помогает в проведении научных исследований и клинических испытаний.
5. Информативность: Метод предоставляет детальную информацию о клеточной и тканевой структуре, что позволяет, лучше понимать патофизиологические процессы.
6. Поддержка терапии: Результаты ИГХ-анализов, полученные при судебно-медицинских исследованиях трупов, могут направлять выбор терапевтических стратегий, включая таргетную терапию, повышая её эффективность.
7. Сравнительная простота визуализации: Окрашенные участки легко визуализировать с помощью микроскопии, что упрощает анализ результатов и их интерпретацию.
8. Долговременное хранение образцов: Окрашенные образцы можно хранить длительное время, что позволяет возвращаться к ним для повторного анализа или исследования.
9. Технологические улучшения: Постоянное развитие и совершенствование технологий ИГХ делают метод всё более доступным и надёжным.

НЕДОСТАТКИ ТЕХНОЛОГИИ ИГХ-метода

Несмотря на явные преимущества метода, в нём также присутствуют и свои недостатки. Ограничение использования в первую очередь зависит от таких факторов, как:

1. Отсутствие достаточного количества специалистов, как с высшим, так и со среднем образованием.
2. Методики окрашивания сложны и длительны, требуется специализированное, узко направленное обучение.
3. Интерпретация полученных результатов может зависеть от опыта и навыка исследователя, что говорит о субьективности метода.
4. Ошибки технике пробоподготовки (например, неправильная либо недостаточная фиксация), могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам.
5. Для каждого нового антитела требуется тщательная валидация, что увеличивает временные и ресурсные затраты на проведение исследований.
6. В некоторых случаях метод может быть недостаточно чувствителен для обнаружения низкоэкспрессируемых маркеров.
7. Высокие закупочные цены на оборудование, реагенты и расходные материалы.
8. Аппаратура для выполнения протоколов исследования громоздка, требует достаточного количества места, в том числе и для создания комфортных условий труда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

В заключении следует отметить, что данный метод исследование существенно внедрился в практическую деятельность судебной медицины. Например, данный момент ИГХ-метод позволяет выявлять тех или иных инфекционных агентов, изучить причины сердечной смерти, в частности, природу миокардитов, более детально и достоверно оценить состояние сосудистой стенки при субарахноидальных кровоизлияниях. Также оценить состояние гладкомышечного волокна, оценить, как начальные признаки изменения в тканях, так и изменения, происходящие с течением времени, при различных видах травм, что немаловажно в определении прижизненности и давности повреждений. Отдельную нишу занимает изучение в повреждённых тканях при черепно-мозговой травме. Не осталась в стороне и детская смертность (эмболия околоплодными водами, инфекционные или иммунодефицитные состояния). Перечислена лишь малая часть областей судебной медицины, где применяется данный метод исследования.

Несмотря на огромный потенциал, существенный вклад в развитие и практическую деятельность судебной медицины ИГХ-метод обладает рядом недостатков. Метод является дорогостоящим и трудоёмким, требующим специализированное оборудования и квалифицированных специалистов.

Достоинства метода, значительно превышают все недостатки. ИГХ-метод значительно расширяет возможности, облегчает понимание, повышает качество судебной медицинской гистологии. В перспективе ИГХ-метод позволит получить ответы на множество вопросов судебной медицины. Данный метод позволит улучшить качество экспертиз, сделает выводы убедительными и объективными.

About the authors

Olga Frolova

Email: olga.frolog@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0785-6819
Россия

Aleksandr V. Maksimov

Author for correspondence.
Email: mcsim2002@mail.ru

Timofey S. Sokolov

Email: slantima@mail.ru

References

Supplementary files