高效液相色谱-串联质谱法检测中毒患者尿液中的氯巴扎姆及其代谢物

全文:

ОБОСНОВАНИЕ

По данным ежегодного токсикологического мониторинга, острые отравления наркотическими средствами остаются актуальной проблемой, а определение факта острого и летального отравления клобазамом до настоящего времени является первостепенной задачей аналитической токсикологии [1]. Судебно-медицинская диагностика отравлений наркотическими средствами и психотропными веществами со смертельным исходом основана на совокупности морфологических данных и результатов определения веществ в биологических жидкостях и тканях трупа. Но только результаты судебно-химического и химико-токсикологического исследования помогают установить вид наркотических средств и психотропных веществ, их концентрацию, что позволяет высказать суждение о времени приёма и принятой дозе этих веществ [2–4].

Лекарственное вещество клобазам относится к группе бензодиазепинов. Клобазам включён в список психоактивных веществ, оборот которых, а также незаконное приобретение, хранение, перевозка, изготовление, переработка без цели сбыта в Российской Федерации ограничены.

Химическое название клобазама: 7-хлор-1-метил-5-фенил-1H-1,5-бензодиазепин-2,4(3H,5H)-дион. Молекулярная формула: C₁₆H₁₃ClN₂O_2. Торговое название: Фризиум. Лекарственная форма: таблетки по 10 и 20 мг.

Клобазам ― противосудорожное, анксиолитическое средство, действует как транквилизатор, считается сильнодействующим препаратом. Клобазам купирует эпилептические приступы, уменьшает напряжённость, раздражение, возбуждение, агрессивность. Клобазам относится ко второму поколению противоэпилептических препаратов [5–7]. Несмотря на то, что клобазам является лекарственным препаратом с меньшими побочными эффектами в сравнении с другими производными бензодиазепинов, он оказывает фармакокинетическое взаимодействие на такие препараты, как карбамазепин, фенитоин, фенобарбитал, примидон, вальпроат, ламотриджин, левитирацетам, окскарбазепин, топирамат, вигабатрин, что обусловливает его влияние на сопутствующую терапию и увеличение или наличие побочных эффектов [8–11].

Клобазам быстро метаболизируется в печени и потом выводится путём почечной элиминации. Через почки выводится менее 1% клобазама и менее 10% метаболита N-дезметилклобазама (норклобазама). Норклобазам значительно более устойчив в организме, чем клобазам, его период полураспада примерно вдвое меньше, чем у клобазама (78–82 и 36–41 ч соответственно), а в терапевтических дозах концентрация в сыворотке крови в 3–5 раз выше [12–16]. При терапевтическом приёме клобазам обнаруживается в биологических жидкостях в диапазоне концентраций 0,1–1 мг/л, токсический эффект начинает проявляться при десятикратном увеличении дозы, а острое отравление может наступить при пероральном приёме 300 мг.

В настоящее время лабораторные методы, которые позволяют обнаружить клобазам и его метаболиты при исследовании биологического объекта (моча) с использованием неинвазивного метода отбора пробы, на современном уровне не описаны. Существует несколько опубликованных методик [16] определения клобазама и норклобазама методом жидкостной и газовой хроматографии с использованием тандемной масс-спектрометрии, которые апробированы на крови или плазме крови. Имеется руководство¹ по пробоподготовке жидкость-жидкостной экстракции при исследовании биологического объекта (мочи).

Актуальность использования при химико-токсикологическом исследовании биологических объектов, отобранных у пациентов (потерпевших), имеет большую важность ввиду того, что применение в медицине клобазама достаточно часто встречается в детском возрасте, тем более что с мочой выводится более 90% препарата.

Цель исследования ― предложить простую, достоверную и чувствительную методику для идентификации клобазама и его метаболита в моче современным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-QqQ-МС/МС) после твердофазной экстракции, не требующую инвазивного вмешательства.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Пробоподготовка

Для анализа использовали жидкостный хроматограф Nexera X2 (Shimadzu, Япония) с масс-спектрометрическим детектором Shimadzu LCMS-8050.

Реактивы: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде с 2 мМ формиата аммония, ацетонитрил, этанол, метанол (чистый для анализа; ч.д.а.), 0,1 М раствора монофосфата калия (KH₂PO₄; химически чистый; х.ч.), 5% уксусной кислоты (ч.д.а.), 2% раствор гидроксида аммония (NH₄OH; ч.д.а.).

В данном исследовании пробоподготовка была выполнена при помощи патронов Agilent Bond Elut Certify (Agilent, США), 130 мг, 3 мл. После кондиционирования патрона 2 мл метанола (ч.д.а.) и уравновешивания 2 мл 0,1 М KH₂PO₄ (х.ч.) пробу мочи человека, употреблявшего клобазам, объёмом 1 мл вводили в патрон. Весь элюат собирали во флакон. Элюент для стадий промывки был разделён на три аликвоты по 1 мл каждая. Первую промывку выполняли 1 мл 5% уксусной кислоты (ч.д.а.), а остальные две ― по 1 мл метанола. Каждую фракцию элюата собирали отдельно во флакон. Элюирование выполняли трижды с помощью 1 мл смеси ацетонитрила (ч.д.а.) с 2% NH₄OH (ч.д.а.). Каждую фракцию собирали отдельно и объединяли для дальнейшего исследования.

Условия хроматографирования

Параметры хроматографической системы LC-System Nexera X2 Shimadzu. Хроматографическая колонка Kinetex (Phenomenex) 2.6u XB-C18 100A 100×2,1 мм. Температура колонки 40°C. Использовалась комбинированная подвижная фаза с двумя компонентами: А ― 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде с 2 мМ формиата аммония; B ― ацетонитрил, объём вводимой пробы 5 мм³.

Условия градиентного режима подачи элюента приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Программа градиентного элюирования / Table 1. Gradient elution program

Время, мин	А, ٪	В, ٪
0.00	99,0	1,0
1.00	99,0	1,0
8.00	1,0	99,0
9.00	1,0	99,0
9.10	99,0	1,0
11.00	99,0	1,0

 

Условия масс-спектрометрического детектирования

Параметры масс-спектрометрического детектирования приведены в табл. 2. Условия регистрации аналитических сигналов были проведены в режиме мониторинга множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM): энергия соударений 20 эВ; напряжение на фрагментаторе 100 В; скорость сканирования 5 спектров/сек. Оптимизацию условий детектирования проводили с использованием рабочего раствора концентрацией 0,1 мкг/см³. Энергию соударений (collision energy, CE) оптимизировали с шагом 10 В по максимальному отклику характеристичного продукт-иона.

 

Таблица 2. Параметры масс-спектрометрического детектирования (трёхквадрупольный масс-селективный детектор, МС QqQ) / Table 2. Parameters of mass spectrometric detection (three quadrupole mass selective detector, MS QqQ)

Параметры интерфейса	Характеристики, ед. изм.
Поток газа-нагревателя (Heating gas flow), л/мин	10
Температура интерфейса (Interface Temperature), °C	300
Температура линии десольвации (DL Temperature), °C	250
Распыление (Nebulizer), л/мин	3
Поток газа-осушителя (Drying Gas Flow), л/мин	10
Температура блока нагревателя (Heat Block Temperature), °C	400
Температура растворения (Dezolvatation Temperature), °C	520
Напряжение на интерфейсе (Interface Voltage), V	4000
Режим детектирования 1	MS2 (Full SCAN) 70–1000 а.е.м.
Режим детектирования 2	MRM

 

Этическая экспертиза

Этический комитет Медицинского центра «Азбука Здоровья» дал положительное заключение (протокол № 1 от 17.01.2022). Забор проб биологической жидкости производили неинвазивным способом, добровольно, с письменного согласия пациентов, на анонимных условиях и обезличенных данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Предварительно изучали раствор стандартного образца клобазама. Для этого получали 0,1% спиртовой раствор клобазама, который количественно стандартизовали методом ультрафиолетовой (УФ) спектрофотометрии. Затем из мерной колбы отбирали 1 мл 0,1% раствора и добавляли 9 мл этанола для получения 0,01% (0,1 мг/мл) раствора клобазама (испытуемый раствор), который количественно стандартизовали методом УФ-спектрофотометрии.

Далее исследовали полученные извлечения из мочи методом ВЭЖХ-QqQ-МС/МС.

Результаты хроматографирования и обнаружения клобазама и норклобазама представлены на рис. 1 и 2.

 

Рис. 1. Хроматограммы клобазама (a) и норклобазама (b) при исследовании методом ВЭЖХ-QqQ-МС/МС. / Fig. 1. Chromatograms of clobazam (a) and norclobazam (b) in the study by HPLC-QqQ-MS/MS.

 

Рис. 2. Масс-спектры клобазама (a) и норклобазама (b) при исследовании методом ВЭЖХ-QqQ-МС/МС. / Fig. 2. Mass spectra of clobazam (a) and norclobazam (b) in the study by HPLC-QqQ-MS/MS.

 

В вышеописанных условиях хроматографирования время удерживания рабочего стандартного образца составило 5,17 мин, а его метаболита, найденного в моче, ― 4,56 мин (см. рис. 1).

Согласно данным рис. 2, МС/МС-параметры аналита следующие: ион-прекурсор клобазама (m/z*) ― 259; фрагментатор (V**) ― 224; ион-прекурсор норклобазама (m/z) ― 245; фрагментатор (V) ― 210. (* После ионизации вещества ионы разделяются в масс-анализаторе в соответствии с их отношением массы к заряду; ** Селективное деление вещества электрическим разрядом, измеряемое в вольтах).

Полученные результаты хроматографирования были статистически обработаны (табл. 3, 4). Как видно из табл. 4, относительное стандартное отклонение норклобазама при хротаматографировании извлечения из мочи составляет 5,5%, что оптимально для извлечения из биологической матрицы с учетом её влияния.

 

Таблица 3. Параметры режима мониторинга множественных реакций (MRM) клобазама и норклобазама / Table 3. Parameters of the multiple reaction monitoring mode (MRM) of clobazam and norclobazam

Аналит	Масса на Q1 → (переход) масса на Q3	Энергия соударений, эВ	Напряжение на фрагменторе, В	Время сканирования одного MRM-перехода
Клобазам	301→210 224	25 37	100	5 спектров/сек
Норклобазам	287→184 210	25 31	100	5 спектров/сек

 

Таблица 4. Статистическая обработка результатов хроматографирования клобазама и норклобазама / Table 4. Statistical processing of chromatography results of clobazam and norclobazam

Параметр	Обнаруженное соединение
	Клобазам	Норклобазам
Время удерживание, n=6	5,174	4,555
Дисперсия, σ2	0,00009	0,06452
Среднеквадратическое отклонение, σ	0,00929	0,25402
Коэффициент вариации, V	0,18%	5,58%
Отношение показателя асимметрии к его ошибке, A/ma	-0,54265	-0,72547
Отношение показателя эксцесса к его ошибке, E/me	-3,19999	-3,07923
Среднее линейное отклонение, ā	0,00638	0,18087

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Получены результаты оптимального хроматографического разделения клобазама/норклобазама от соэкстрактивных веществ биологической матрицы мочи. Поскольку пациенты обычно скрывают приём клобазама, а также в случае намеренного отравления клобазамом сторонним лицом, для окончательного диагноза отравления клобозамом требуется инструментальный токсикологический анализ. Следует отметить, что в России анализ мочи является обязательным при проведении токсикологического анализа. По этой причине в настоящем исследовании сообщается о проверенном методе определения клобазама в моче. Разработанный метод чувствителен, включает в себя простую и быструю пробоподготовку, для которой требуется всего 0,5 мл биологического образца.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

Клобазам и норклобазам были измерены в образцах биологического объекта (моча) качественно в соответствии с руководством Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) по валидации биоаналитического метода². Хроматограммы образцов мочи не выявили интерферирующих соединений в матрице во время удерживания анализируемых веществ. Нижний предел количественной оценки (lower limit of quantification, LLOQ) был установлен на уровне 0,1 нг/ мл для клобазама/норклобазама в обеих матрицах. Отношение сигнал/шум при LLOQ составило >10. Предел обнаружения (limit of detection, LOD) был определён как 0,05 нг/ мл для клобазама/норклобазама. Точность и прецизионность внутрисуточных и межсуточных измерений соответствовали критериям FDA, принятым для анализа аналитов в моче.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан и валидирован простой и чувствительный метод ВЭЖХ-QqQ-МС/МС для идентификации клобазама и норклобазама в образцах мочи пациентов с отравлением клобазамом. Впервые представлена валидированная методика химико-токсикологического исследования при отравлении клобазамом методом ВЭЖХ-МС/МС, апробированная как на модельной смеси, так и на реальной биологической матрице мочи пациента после приёма клобазама.

Данная методика может применяться в качестве подтверждающего метода исследования и дополнять клиническую картину в судебно-медицинской экспертизе.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.А. Волкова, Р.А. Калёкин, А.М. Орлова ― сбор данных, написание текста рукописи, научное редактирование текста рукописи, рассмотрение и одобрение окончательного варианта рукописи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. A.A. Volkova, R.A. Kalekin, A.M. Orlova ― data collection, writing the text of the manuscript, critical revition of the manuscript for important intellectual content, review and approve the final manuscript.

 

¹ Guidance for industry: Bioanalytical method validation. Food and Drug Administration. U.S. Department of Health and Human Services [accessed December 4, 2020]. Режим доступа: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf.

² Guidance for industry: Bioanalytical method validation. Food and Drug Administration. U.S. Department of Health and Human Services [accessed December 4, 2020]. Режим доступа: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf.

作者简介

Alla A. Volkova

Russian Centre of Forensic Medical Expertise; Peoples› Friendship University of Russia

Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-9882-2330

Cand. Sci. (Pharm.)

俄罗斯联邦, 12/13, Polikarpov Street, Moscow, 125284; Moscow

Roman A. Kalekin

Russian Centre of Forensic Medical Expertise; Peoples› Friendship University of Russia

编辑信件的主要联系方式.
Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-4989-3511
SPIN 代码: 2473-7421

Dr. Sci. (Pharm.)

俄罗斯联邦, 12/13, Polikarpov Street, Moscow, 125284; Moscow

Alevtina M. Orlova

Russian Centre of Forensic Medical Expertise

Email: himija@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-5419-1418
SPIN 代码: 7685-2315

Cand. Sci. (Pharm.)

俄罗斯联邦, 12/13, Polikarpov Street, Moscow, 125284

参考

补充文件