毒蝇伞毒理学相关特性和中毒时的化学毒理学分析： 科学综述

全文:

Введение

С каждым годом научно-практическое сообщество уделяет всё больше внимания отравлениям галлюциногенными грибами. Отдельную проблему представляют отравления грибами из рода мухомор (Amanita). По данным отделения острых отравлений и соматопсихиатрических расстройств Научно-исследовательского института скорой помощи имени Н.В. Склифосовского, за последние 4 года наблюдают увеличение случаев отравления мухоморами до 260, при этом в 2023 году их количество составило 94, а в первом полугодии 2024 г. — 55 [1]. К основным видам мухоморов, употребление которых приводит к увеличению случаев отравления, относят мухомор красный (A. muscaria) и пантерный (A. pantherina).

С древних времён по причине своих психодислептических свойств мухоморы применяли для достижения изменённого состояния сознания в религиозных шаманских практиках. Сейчас же мухоморы используют, преследуя следующие цели: достижение психодислептического эффекта, религиозные обряды, исследовательские цели и достижение терапевтического эффекта.

Кроме того, не стоит забывать случаи ошибочного употребления мухоморов в пищу [2, 3]. Встречают также эпизоды отравления домашних животных [4]. Во многом это может быть связано с недостаточной информированностью населения о грибах и их эффектах, а также с распространением практики микродозинга [5].

Микродозинг — приём психоделически активных веществ в подпороговых дозах (микродозах), не вызывающих интоксикации или изменения сознания, с целью улучшения творческих и физических способностей, достижения эмоциональной стабильности и снижения тревожности [6, 7].

О растущей популярности данной практики свидетельствует увеличение количества рекламы и онлайн-магазинов, предлагающих различные продукты для микродозинга. Косвенно судить о потребительском спросе на продукцию из мухоморов можно с помощью анализа количества поисковых запросов. Так, с 2022 по 2023 год количество запросов в поисковой системе Google, связанных с A. muscaria, увеличилось на 114%, кроме того, в 2024 году этот показатель продолжает расти [5].

Существуют различные продукты на основе мухоморов, используемые для микродозинга, — от фасованного сушёного сырья и порошков до капсул, настоек, экстрактов и кремов. На отечественном рынке присутствуют сертифицированные продукты, зарегистрированные как пищевые добавки. По информации, предоставляемой производителем, данные продукты полезны для:

• стимуляции когнитивных функций;
• коррекции сна;
• уменьшения тревоги;
• улучшения концентрации внимания;
• повышения физической активности.

Некоторые препараты рекламируют как добавки, используемые в комплексном лечении алкогольной зависимости и даже синдрома дефицита внимания и гипер-активности, при отказе от антидепрессантов [5].

В связи с этим особенно остро встал вопрос изучения и разработки физико-химических аналитических методов, позволяющих подтвердить отравление мухоморами, определить степень тяжести и, таким образом, оказать соответствующую и своевременную медицинскую помощь.

В данной статье представлена информация о морфологии, токсикологически значимых свойствах, а также способах идентификации токсинов для дальнейшей разработки лабораторного метода определения отравлений грибами из рода Amanita.

Виды мухоморов

Внешний вид плодовых тел грибов вида мухомор красный (A. muscaria) представлен на рис. 1, а.

• Шляпка 5–20 см (в некоторых случаях до 50 см).
• Форма шляпки — сначала почти шаровидная, потом от выгнутой до вогнутой.
• Цвет шляпки — от ярко-красного до оранжевого или почти жёлтого.
• Бородавки — белые или желтоватые, однако они могут отсутствовать.
• Обратная сторона шляпки — пластинчатая.
• Ножка — присутствуют бородавки у клубневидного утолщения и белое кольцо, с возрастом повисающее.
• Имеет приятный запах и вкус.

 

Рис. 1. Внешний вид плодовых тел грибов: a — мухомор красный (Amanita muscaria); b — мухомор пантерный (Amanita pantherina). © Wikipedia, 2006. Распространяется на условиях лицензии CC BY-SA 3.0.

Fig. 1. Appearance of fruiting bodies of mushrooms: a — red fly agaric (Amanita muscaria); b — panther fly agaric (Amanita pantherina). © Wikipedia, 2006. Distributed under license CC BY-SA 3.0.

 

Гриб A. muscaria является космополитом и распространён во всех лесах Российской Федерации (РФ) [8–10]. Он является эктомикоризным грибом — вступает в симбиоз как с хвойными, так и лиственными деревьями [4].

На рис. 1, b представлен внешний вид плодовых тел грибов вида мухомор пантерный (A. pantherina).

• Форма шляпки — округлая с плоским углублением в центре.
• Цвет шляпки — коричневый, часто с зеленоватым оттенком, но никогда не имеет красноватый и желтоватый оттенок.
• Бородавки — белого или сероватого цвета, расположены концентрически.
• Ножка — белая с повисающим поясом, который обычно быстро исчезает.
• В основании ножки особая мешковидная воротничковая вольва.
• Безвкусный, а запах похож на сырой картофель.

Гриб A. pantherina распространён в северной и умеренной зонах РФ, а также в горных лесах [8–10].

Необходимо отметить, что оборот мухоморов в РФ легален, однако в некоторых странах его контролируют, в частности оборот их основных действующих веществ — мусцимола и иботеновой кислоты. Сбор и употребление мухомора красного запрещены в Румынии, Голландии, на Тайване и в Луизиане (Соединённые Штаты Америки). Тем не менее сбор и употребление мухомора пантерного не контролируют нигде. В Австралии контролируют оборот мусцимола, но не грибов [5, 9].

Химический состав

Количество действующих веществ в теле гриба зависит от ряда факторов:

• географической расы;
• сезона;
• фазы и условий роста;
• вариантов обработки и хранения [9].

 

Рис. 2. Структурные формулы производных изоксазола: a — иботеновая кислота; b — мусцимол.

Fig. 2. Structural formulas of isoxazole derivatives: a — ibotenic acid; b — muscimol.

 

Основные токсикологически значимые компоненты мухоморов — иботеновая кислота (рис. 2, а) и мусцимол (см. рис. 2, b), являющиеся производными изоксазола. Наибольшее количество иботеновой кислоты и мусцимола содержится в шляпке гриба, чуть меньше — в вольве, самое минимальное — в ножке. Данные вещества обладают относительно высокой температурой кипения — 152 и 175 °С соответственно. Значения показателя константы кислотности (pKa) для мусцимола — 4,8 и 8,4 [11], а для иботеновой кислоты — 3,0, 5,0 и 8,2 [12], что указывает на её более выраженные кислотные свойства. В чистом виде это кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде. Кроме того, они могут проходить через гематоэнцефалический барьер за счёт наличия активных переносчиков в головном мозге [8]. В водной среде иботеновая кислота, являясь аминокислотой, образует цвиттер-ион¹, что вызывает некоторые сложности при пробоподготовке и её определении хроматографическими методами [11]. Иботеновая кислота нестабильна при химическом (в том числе в желудочно-кишечном тракте), световом и температурном воздействии, поскольку при дегидратации она превращается в мусцимол — первичный амин, или декарбоксилированную форму (см. рис. 2, b) [8–10, 13].

В мухоморах содержится и другое производное изоксазола — мусказон. Он образуется в результате воздействия ультрафиолетовых лучей на мусцимол и способен усиливать его галлюциногенное действие на организм. Это объясняет почему мухоморы, собранные на солнечных полянах, обладают более сильным психодислептическим эффектом по сравнению с теми, что выросли в тени [5].

Кроме того, в мухоморах содержатся: трихоломовая, стизолобовая, стизолобиновая, метилтетрагидрокарболинкарбоновая (МТК) кислоты, а также различные виды алкалоидов [8, 9, 14–16]. Стизолобовая и стизолобиновая кислоты — аминокислоты небелкового происхождения, продукты окисления L-диоксифенилаланина (3,4-дигидроксифенилаланина). Их чаще всего обнаруживают в плодовых телах грибов A. pantherina. В грибах A. muscaria эти аминокислоты содержатся в следовых количествах, причём чаще в грибах с желтоватой шляпкой. В то же время в экстрактах из плодовых тел мухомора красного содержится МТК, имеющая структуру, схожую с гармалиновыми соединениями [16]. Среди их основных алкалоидов выделяют мускарин и азотистые соединения паслёновых (скополамин, атропин, гиосциамин), реже — буфотенин (ядовитое вещество кожи жаб) [5]. Следует отметить, что мухоморы обладают способностью к биокумуляции определённых металлов в виде металлоорганических соединений, что в некоторых случаях может способствовать повышению их токсичности. Например, в мухоморе красном ванадий накапливается в виде амавадина [3].

Клиническая картина отравления

Различные виды и даже популяции одного и того же вида могут обладать разным действием в зависимости от содержащихся веществ. Этим обусловлено деление эффектов грибов рода Amanita на микоатропиновый и пантериновый синдромы [9, 10]. Основные клинические характеристики отравлений разными видами мухоморов представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные синдромы, возникающие при отравлении различными видами мухоморов, и их характеристики Table 1. Main syndromes appearing in case of poisoning by different species of genus Amanita mushrooms and their characteristics
Микоатропиновый	Пантериновый
Отсутствие чёткой картины отравления, легко спутать с другими состояниями — нарушением мозгового кровообращения, алкогольным опьянением, реже гастроэнтеритом и др.
Виды мухоморов (Amanita)
A. muscaria; A. regalis; A. gemmate; A. strobiliformis	A. pantherina
Основные вещества
иботеновая кислота; мусцимол; мусказон	иботеновая кислота; мусцимол; мусказон; паслёновые алкалоиды: скополамин, атропин
Особенности
больше иботеновой кислоты; преобладание возбуждения над угнетением; выраженная спутанность сознания, ажитации	эффект в 3–4 раза сильнее; больше мусцимола; большее содержание паслёновых алкалоидов; преобладание угнетения над возбуждением; часто развивается кома

 

Микоатропиновый синдром — комплекс симптомов, схожий с действием атропина и вызываемый производными иботеновой кислоты, содержащимися в грибах. Данный синдром возникает при употребление следующих видов грибов:

• мухомора красного (A. muscaria);
• мухомора королевского (A. regalis);
• мухомора ярко-жёлтого (A. gemmata);
• мухомора шишковидного (A. strobiliformis) [8, 9].

Употребление мухомора пантерного вызывает схожий синдром — пантериновый. Оба синдрома развиваются в течение 15–30 мин после употребления под действием производных изоксазола и небольших количеств алкалоидов, поэтому данный вид отравления не обладает специфической клинической картиной и симптомы непостоянны [17]. При отравлении мухоморами, в отличие от острых интоксикаций другими видами ядовитых грибов, не всегда наблюдают развитие синдрома токсической гастроэнтеропатии и признаков гастроэнтерита, даже при посмертном вскрытии [16, 18]. По этим причинам зачастую в клиниках диагностируют совершенно другие патологии, в частности алкогольную интоксикацию, цереброваскулярную болезнь и др. [17]. Однако для пантеринового синдрома характерно преобладание угнетения деятельности центральной нервной системы (ЦНС) над возбуждением, а при микоатропиновом — выражен противоположный эффект. Это связано с большим содержанием иботеновой кислоты в грибах микоатропинового ряда и мусцимола — в мухоморе пантерном [14, 17]. Следует отметить, что не существует специфического антидота, а в случае развития отравления осуществляют только поддерживающую и симптоматическую терапию [3].

В мухоморах, вызывающих микоатропиновый синдром, содержится иботеновая кислота — основной психодислептический компонент. Она представляет собой аналог глутаминовой кислоты и может стимулировать различные виды глутаматных рецепторов. Основная мишень — инотропные рецепторы глутамата, селективно связывающие N-метил-D-аспартат (NMDA-рецепторы). Воздействие на них приводит к активации нервной системы [8, 15]. Именно поэтому иботеновую кислоту используют для моделирования болезни Альцгеймера на крысиных моделях [3, 12].

Первая стадия фазы возбуждения характеризуется относительно безобидными симптомами:

• прилив физической силы;
• эмоциональный подъём;
• уверенность в себе;
• бодрость;
• увеличение концентрации внимания [2, 17].

Все вышеперечисленные проявления связаны со способностью иботеновой кислоты влиять на повышение содержания серотонина. В этом проявляется её схожесть с ЛСД (диэтиламидом d-лизергиновой кислоты) [3].

Вторая стадия характеризуется следующими проявлениями:

• сильное психомоторное возбуждение — судороги, которые особенно часто развиваются у детей [19], атаксия;
• эмоциональное возбуждение — вплоть до истерии;
• появление иллюзий по типу микро- и макропсии, затуманенного зрения, размытости изображения и стирания очертаний объектов (как при мигренозной ауре);
• появление зрительных, слуховых и вкусовых галлюцинаций [2, 17].

Возбуждение заканчивается третьей стадией, во время которой наблюдают усиление галлюцинаций, потерю ориентации и координации. Галлюциногенный эффект также обусловлен воздействием МТК на ЦНС [16]. Человек не осознаёт себя и происходящее вокруг. В итоге наступает фаза угнетения [2, 17].

Угнетение развивается в основном в результате эффектов мусцимола. Он структурно схож с γ-аминомасляной кислотой (ГАМК) — главным тормозным медиатором ЦНС, поэтому мусцимол взаимодействует с ГАМК_А-рецептором и частично ГАМК_С [8, 15]. При этом он может относительно долго оказывать супрессорное действие, поскольку, в отличие от ГАМК, не подвержен воздействию ГАМК-трансаминаз или систем её обратного захвата. Кроме того, угнетение во многом связано со способностью мусцимола снижать концентрацию катехоламинов в ЦНС. Иботеновая кислота, наоборот, стимулирует увеличение их содержания [3]. Для данной фазы характерно:

• угнетение сознания;
• вялость;
• истощение;
• апатия;
• сонливость.

Чаще всего угнетение заканчивается «тяжёлым» сном с повышенными порогами пробуждения и яркими запоминающимися сновидениями. Пробуждение обычно сопряжено с ретроградной амнезией [16]. В случае развития пантеринового синдрома угнетение преобладает над возбуждением, а его фаза более длительная и часто заканчивается комой [2, 14, 17]. При единовременном употреблении большого количества мухомора пантерного происходит быстрый переход (30–60 мин) от начальных стадий к коме. Фазы угнетения и возбуждения могут многократно повторяться и чередоваться [16].

Течение перечисленных синдромов сопровождается также следующими проявлениями:

• мидриаз (реже миоз [16]);
• одышка;
• тахикардия (в фазе возбуждения) и брадикардия (в фазе угнетения);
• слюно- и слезотечение;
• усиленное потоотделение;
• приступы боли в животе.

Боль в животе связана с воздействием мускарина, содержание которого в обоих видах мухоморов весьма незначительно, однако с учётом плохой абсорбции алкалоида при пероральном поступлении его роль в токсическом действии минимальна [17]. За антихолинергические эффекты в основном отвечают стизолобовая и стизолобиновая кислоты [16]. Спазмы разных отделов желудочно-кишечного тракта в основном связаны со способностью мусцимола увеличивать концентрацию серотонина [3]. Рвота и диарея возможны в случаях тяжёлого отравления [16].

Таким образом, клиническая картина очень вариабельна и обусловлена сильными колебаниями в содержании иботеновой кислоты и мусцимола, а также других веществ, отвечающих за развитие интоксикации. При диагностике большое значение имеет выявление наиболее характерных симптомов для данного синдрома [9, 16].

Для запуска патологических процессов в нервной системе достаточно одного плодового тела гриба весом около 50–70 г. В нём может содержаться 0,015–0,1% производных изоксазола (мусцимола и иботеновой кислоты — около 6 и 30–60 мг соответственно) [3, 12, 16]. Необходимо подчеркнуть, что галлюциногенный эффект возникает при воздействии мусцимола и иботеновой кислоты — 10–15 и 50–100 мг соответственно [11]. Наиболее тяжёлые случаи отравления регистрируют у детей, лиц старшего возраста и при соответствующем преморбидном фоне [19, 20]. Однако в большинстве случаев отравление этими видами мухоморов заканчивается благоприятно через 24–49 часов после начала развития симптомов [16]. Вероятность летального исхода существенно возрастает при употреблении других видов грибов рода Amanita:

• A. phalloides (бледная поганка);
• A. verna (мухомор весенний);
• A. virosa (мухомор вонючий) [21].

Смертельные случаи при отравлении грибами A. muscaria и A. pantherina крайне редки и чаще всего происходят либо при остром отравлении большим количеством грибов [12, 16, 20], либо при отравлении, сочетанном с применением транквилизаторов (например, бензодиазепинов) [20]. Смерть наступает в результате остановки сердечной деятельности и дыхания [22], при аутопсии не наблюдают патоморфологических признаков, характерных для отравления мухоморами [16]. В условиях опыта на крысах показано, что «летальная доза» (LD₅₀) при внутривенном введении мусцимола составляла 4,5 мг/кг, а при пероральном — 45 мг/кг. Производные изоксазола хорошо растворимы в воде, поэтому часть соединений относительно быстро выводится в неизменном виде. Иботеновую кислоту и мусцимол можно идентифицировать в моче уже через час после поступления в организм. Тем не менее около 10–20% иботеновой кислоты претерпевает превращения и переходит в мусцимол уже на стадии переваривания грибов — в кислой среде желудка [3, 12]. Кроме того, её метаболизм происходит в печени и головном мозге [3].

Химико-токсикологический анализ

На данный момент существует большое количество способов для выявления отравления мухоморами. Ранее одним из методов подтверждения приёма этих грибов было проведение макро- и микроскопии содержимого желудка или кишечника на наличие кусочков грибов и характерных грибных спор. Однако микроскопия представляет собой очень трудоёмкий метод, который более применим при посмертной идентификации [4, 12]. В случае использования данных методов велика вероятность ошибки, поскольку при измельчении, а также под действием секретов желудка и кишечника ткани гриба разрушаются и теряют специфические морфологические признаки, что делает невозможной визуальную идентификацию. Часто при появлении диспептических симптомов отравления в качестве самолечения используют сорбенты — активированный уголь. Он ещё больше затрудняет идентификацию гриба, так как окрашивает химус в чёрный цвет.

В некоторых случаях для установления этиологии отравления использовали полимеразную цепную реакцию. Однако это позволяло лишь определять вид гриба, но не количество попавших в организм токсикантов. Даже при использовании генных баз данных (например, GenBank²) и алгоритмов поиска аминокислотных последовательностей (например, BLAST³) существует вероятность неточного определения вида, поскольку многие грибы растут совместно (например, в химусе можно обнаружить плесневые грибы) [4].

Для определения степени тяжести отравления и дальнейшего эффективного мониторинга терапии необходимо выявление конкретных токсикантов [11]. Наиболее рациональными как для качественного, так и количественного определения иботеновой кислоты и мусцимола являются физико-химические высокотехнологичные методы: хроматография и электрофорез. При этом необходима подготовка пробы биообъекта, заключающаяся в очистке аналитов⁴ от сопутствующих веществ биологической матрицы.

Пробоподготовка

В качестве метода пробоподготовки используют экстракцию. Свежие плодовые тела грибов измельчают, а высушенные образцы истирают до порошка. Одноэтапную однофазную экстракцию используют в основном для пробоподготовки к качественной идентификации. В связи с высокой гидрофильностью иботеновой кислоты и мусцимола для экстракции используют различные системы полярных растворителей: метанол с водой в соотношении 7:3, 50% этанол и 0,1% раствор муравьиной кислоты [15]. Универсальным экстрагентом считают 75% метанол, поскольку он блокирует декарбоксилазу, стабилизируя иботеновую кислоту и препятствуя её переходу в мусцимол. По этой же причине метанол используют для хранения образцов свежих грибов, помещая 1 г сырья в 4 мл метанола. Далее полученный образец хранят при температуре 4 °С [23].

Для количественного анализа таких биообъектов, как моча, плазма, получают более высокоочищенные экстракты. Это важно для рационального использования хроматографических колонок. Кроме того, дансилхлорид, часто используемый для дериватизации⁵ в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), может реагировать как с искомыми иботеновой кислотой и мусцимолом, так и с аминокислотными остатками белков (при анализе плодовых тел, плазмы), что снижает чувствительность методики [24]. Обычно применяют многоэтапную жидкость-жидкостную или твердофазную экстракцию (табл. 2).

 

Таблица 2. Схемы изолирования иботеновой кислоты и мусцимола из биообразцов Table 2. Isolation schemes of ibotenic acid and muscimol out of bioassays
Пробоподготовка	Источник
Плазма
экстракция в смесь раствора муравьиной кислоты с ацетонитрилом; центрифугирование; дансилирование; экстракция в дихлорметан в кислой среде; сушка в токе азота; перерастворение в ацетонитриле с водой	[24]
Моча
ионный обмен; промывка подкисленным этанолом (HCl), удаление водного слоя; этилирование; очистка пиридином; сушка в токе азота; перерастворение в этилацетате	[27]
разведение 1:10 или 1:100 смесью подвижной фазы при высоких концентрациях изоксазолов и концентрирование с помощью твердофазной экстракции при низких концентрациях; высушивание в токе азота; перерастворение в смеси подвижной фазы — ПФ-А и ПФ-Б 1:1	[28]
Плодовые тела (высушенные)
экстракция в 50% этанол; фильтрация; многоступенчатая очистка органическими растворителями; реэкстракция в метанол	[29]
экстракция в 50% метанол центрифугирование твердофазная экстракция (элюент — муравьиная кислота в метаноле); выпаривание; перерастворение в смеси муравьиной кислоты и метанола	[30]
двукратная экстракция в смеси метанол : вода — 7:3; центрифугирование	[26]
экстракция в 70% метанол с ультразвуковой баней; центрифугирование; триметилсилирование	[25]

 

Качественный анализ

Для качественной идентификации наиболее часто используют тонкослойную хроматографию (ТСХ) и газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) с масс-селективным детектором (ГЖХ-МС). При исследовании методом ТСХ анализируют метанольный экстракт, полученный из свежих, замороженных и высушенных плодовых тел грибов. Подвижная фаза может быть представлена различными системами растворителей, например:

• н-пропанол : 10% раствор аммиака — 95:5;
• н-бутанол : уксусная кислота : вода — 60:20:20 и т. д.

Неподвижная фаза чаще всего — силикагель [23]. В качестве детектора можно использовать нингидрин и флюоресцамин с последующей ультрафиолетовой обработкой [25] и реже — пентоцианоферритиновые реагенты, дающие пурпурные пятна. Стоит учитывать, что нингидрин будет взаимодействовать не только с МТК, но и небелковыми аминокислотами — стизолобовой и стизолобиновой. Однако они будут давать оранжевую и жёлто-коричневую окраску соответственно [16]. ТСХ в препаративном варианте можно использовать для очистки и подготовки к дальнейшему анализу методами ГЖХ и ВЭЖХ. При этом для элюирования используют н-бутанол, этанол, водный раствор уксусной кислоты [26].

Существуют различные аппаратурные хроматографические методики, основная информация по ним приведена в табл. 3.

 

Таблица 3. Схемы химико-токсикологического анализа плазмы крови и мочи на наличие иботеновой кислоты и мусцимола, а также химический анализ плодовых тел грибов с помощью хроматографических методов Table 3. Schemes of chemical and toxicological analysis of blood plasma and urine for the presence of ibotenic acid and muscimol and chemical analysis of mushroom fruiting bodies via chromatographic methods
Метода	Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Детектор	Условия	Метод расчёта	Источник
Плазма
ОФ-ВЭЖХ	А — 10 мМ муравьиная кислота и 6 мМ формиат аммония; Б — ацетонитрил	неполярная С18 с гептафтормасляной кислотой	времяпролётный; масс-спектрометрический	дансилирование; градиентный режим; 30 °С	Внутренний стандарт: иботеновая кислота — L-тирозин-13C9,15N; мусцимол — тирамин-d4	[24]
Моча
ГЖХ-МС	гелий	полуполярная колонка HP–5MS UI® (Agilent Technologies, Соединённые Штаты Америки)	масс-спектрометрический	этилирование	Внутренний стандарт: циклосерин	[27]
ВЭЖХ-МС/МС	А — 10 мМ аммоний ацетат в смеси вода : ацетонитрил —1:9; Б — 0,1% водный раствор муравьиной кислоты	полуполярная колонка ZORBAX StableBond SB-CN® (Agilent Technologies, Соединённые Штаты Америки)	масс-спектрометрический с квадруполь-орбитальной ловушкой	градиентный режим; 40 °С; положительная ионизация	Внешний стандарт: иботеновая кислота; мусцимол	[28]
Плодовые тела (высушенные)
ВЭЖХ, СВЭЖХ	ацетонитрил : аммония ацетат 10 мМ — 80:20 pH 6,8	жидкостная хроматография в режиме гидрофильных взаимодействий — силикагель с пришитым триазолом	ультрафиолетовый, 255 нм	изократический режим	Метод добавок	[29]
ВЭЖХ-МС/МС	А — 0,5% водный раствор муравьиной кислоты; Б — смесь 0,5% муравьиной кислоты и ацетонитрила	силикагель с пришитыми карбамоильными группами — TSK-GEL Amide-80® (Tosoh Bioscience, Япония)	масс-спектрометрический	градиентный режим	Внутренний стандарт: ацивицин	[30]
ОФ-ВЭЖХ-МС	А — 10 мМ ацетат аммония; Б — ацетонитрил	неполярная С18	масс-спектрометрический; диодно-матричный (256 нм)	градиентный режим; дансилирование с этилированием; 40 °С	Внешний стандарт: мусцимол; иботеновая кислота	[26]
ГЖХ-МС	гелий	полуполярная колонка DB–5MS® (Agilent Technologies, Соединённые Штаты Америки)	масс-спектрометрический	триметилсилирование	Внешние стандарты: мусцимол; иботеновая кислота. Внутренний стандарт: н-пентадекан	[25]
Примечание. ОФ-ВЭЖХ — обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; СВЭЖХ — сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография; ГЖХ — газо-жидкостная хроматография; МС — масс-спектрометрическое детектирование. Note. ОФ-ВЭЖХ — reversed-phase high-performance liquid chromatography; СВЭЖХ — ultra-high performance liquid chromatography; ГЖХ — gas-liquid chromatography; МС — mass-spectrometric detection.

ГЖХ-МС проводят только после этапа дериватизации⁵, поскольку вещества имеют довольно высокую температуру кипения, в свою очередь, иботеновая кислота термически нестабильна [25]. Кроме того, при прямом определении иботеновой кислоты и мусцимола без дериватизации⁵ в масс-спектре чаще всего наблюдают только один характерный переход для каждого из веществ:

• иботеновая кислота — 159 → 113;
• мусцимол — 115 → 98.

Тем не менее этого недостаточно для точной идентификации токсикантов [24]. Получают триметилсилильные и этильные производные [25, 27]. При идентификации в моче используют этилирование, но также ведут разработки в отношении методик определения триметилсилированных соединений [1]. Неподвижная фаза чаще всего представлена полуполярными сорбентами диоксида кремния с пришитыми фенольными группами, а газ-носитель — гелий [25, 27].

ВЭЖХ считают наиболее эффективным методом. При предположительно высоких концентрациях иботеновой кислоты и/или мусцимола в биожидкостях пробы разводят в 10 или 100 раз, а при низких — проводят концентрирование с помощью твердофазной экстракции. В качестве подвижных фаз чаще всего используют смеси формиатных или ацетатных буферных растворов и ацетонитрила. Наиболее предпочтительный режим — градиентный, что связано с различиями в кислотно-основных свойствах определяемых веществ, а также со способностью иботеновой кислоты образовывать цвиттер-ион¹ в водной среде [13]. Наиболее предпочтительно использовать более полярные сорбенты, поскольку неполярные колонки типа С18 будут снижать эффективность хроматографии в связи с высокой полярностью определяемых веществ [24, 26–30]. Для расчётов концентрации используют как метод внутреннего, так и внешнего стандарта, и гораздо реже — метод добавок (см. табл. 3).

Электрофоретические методы определения

Следует отметить, что хроматографические методы достаточно сложны и длительны в исполнении, особенно в случае многостадийной пробоподготовки с дериватизацией⁶, относительно дорогие, что ограничивает их использование при необходимости получения быстрого результата.

 

Таблица 4. Схемы химико-токсикологического анализа мочи на наличие производных иботеновой кислоты, а также химический анализ плодовых тел грибов с помощью капиллярного электрофореза Table 4. Schemes of chemical and toxicological analysis of urine for the presence of ibotenic acid derivates and chemical analysis of mushroom fruiting bodies via capillary electrophoresis
Пробоподготовка	Параметры вкола	Условия			Детекция	Время анализа, мин	Порог обнаружения		Источник
		pH	T, °С	Особые условия			Иботеновая кислота	Мусцимол
Моча
пятикратное разведение деионизированной водой; фильтрация через мембранный микрофильтр с порами 0,22 мкм	0,1 атм; 5 с	2,7	25	создание среды с помощью 0,2 М уксусной кислоты; ионизация электроспреем в изократическом режиме	масс-спектрометрическая	24	0,15 нг/мл	0,05 нг/мл	[12]
Капельная микроэкстракция; экстракция от донорной фазы в октанол (pH 4); реэкстракция в водную фазу (pH 3)	0,0068 атм; 1 с	3	18	появление креатинина на электрофореграмме	диодно-матричная — 214 нм	7	—	16 мкг/л	[11]
Сухие плодовые тела
экстракция в смесь метанола и буферного раствора с ультразвуком; фильтрация и выпаривание экстракта; растворение в смеси метанола и буфера — 2:1	0,034 атм; 5 с	3	22	подвижная фаза содержит 5% ацетонитрила	диодно-матричная — 214 нм	20	1,5 мкг/мл	1,8 мкг/мл	[24]

 

В связи с этим особое внимание стали уделять капиллярному электрофорезу с диодно-матричным или масс-спектрометрическим детектором (табл. 4). Среди основных преимуществ электрофореза выделяют:

• оперативность;
• простоту пробоподготовки;
• высокую чувствительность в отношении иботеновой кислоты и мусцимола.

В сочетании с тандемной масс-спектрометрией данный метод позволяет идентифицировать производные изоксазола в моче при сравнительно низком пороге обнаружения: для иботеновой кислоты и мусцимола — 0,15 и 0,05 нг/мл соответственно [5]. Детектируются следующие характерные переходы:

• иботеновая кислота — 159 → 113 и 159 → 99;
• мусцимол — 115 → 98 и 115 → 86 [12, 24].

Для определения мусцимола разработан более быстрый и эффективный метод, при котором пробоподготовка представлена микроэкстракцией. Донорная фаза — моча, разведённая фосфатным буфером до pH 4. Она содержит большое количество анионов дигидрофосфата, которые образуют нейтральные ионные пары с положительно заряженным мусцимолом. Ионные пары экстрагируют в октанол, а далее под действием градиента концентрации переходят в акцепторную, более кислую фазу (pH 3), где количество дигидрофосфат-ионов меньше, а катионов мусцимола больше. Акцепторная фаза подвергается электрофорезу. Данный метод требует минимальное количество химических реагентов, быстр в исполнении (7 мин) и позволяет проанализировать всего лишь 200 мкл образца [11].

Заключение

В результате анализа опубликованной литературы выявлена общемировая тенденция к увеличению случаев употребления грибов рода Amanita, в частности A. muscaria и A. pantherina, путём микродозинга для улучшения творческих и физических способностей, эмоционального благополучия, что сопровождается ростом числа отравлений данными грибами. Это связано с низкой осведомлённостью населения об их фармакологических эффектах и широкой доступностью на рынке различных продуктов на основе мухоморов. Именно поэтому важно разработать и внедрить в токсикологическую практику методы, позволяющие быстро и точно выявлять активные веществ в биообразцах, содержащиеся в грибах A. muscaria и A. pantherina, — мусцимол и иботеновую кислоту.

Среди существующих методов наиболее распространёнными являются хроматографические — ГЖХ и ВЭЖХ. Среди экспресс-методов и одновременно c хорошей чувствительностью выделяют электрофорез с масс-спектрометрическим или диодно-матричным детектированием, что делает его перспективным направлением для разработки методов химико-токсикологического анализа при отравлении мухоморами.

Дополнительная информация

Вклад авторов. В.А. Зеленщикова — концепция работы, сбор и анализ литературных данных, написание текста рукописи; М.В. Белова, Е.В. Мельник — концепция работы, сбор и анализ литературных данных, редактирование рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы благодарят В.В. Северцева за предоставление информации о статистике отравлений грибами рода мухомор по данным отделения острых отравлений соматопсихиатрических расстройств Научно-исследовательского института скорой помощи имени Н.В. Склифосовского; В.С. Кульбацкого за предоставление методических рекомендаций по анализу производных изоксазола.

Этическая экспертиза. Неприменимо.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один внешний рецензент, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

Additional information

Authors’ contributions. V.A. Zelenshchikova: concept of the work, collection and analysis of literary data, writing the manuscript; M.V. Belova, E.V. Melnik: concept of the work, collection and analysis of literary data, editing the manuscript. Thereby, all authors provided approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgment. The authors express their gratitude to V.V. Severtsev for providing information on the statistics of poisoning by mushrooms of the genus fly agaric according to the department of acute poisoning of somatopsychiatric disorders of the Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine; to V.S. Kulbatsky for providing methodological recommendations on the analysis of isoxazole derivatives.

Ethics approval. Not applicable.

Funding sources. No funding.

Disclosure of interests. The authors declare that they have no relationships, activities or interests over the past three years related to third parties (commercial and non-commercial) whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality. When creating this work, the authors did not use previously published information (text, illustrations, data).

Data availability statement. The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work.

Generative AI. Generative AI technologies were not used for this article creation.

Provenance and peer-review. This article was submitted to the Journal on an unsolicited basis and reviewed according to the usual procedure. One external reviewer, a member of the editorial board, and the scientific editor of the Journal were involved in the review process.

 

¹ Цвиттер-ион (биполярный ион) — молекула, которая, являясь в целом электронейтральной, в своей структуре имеет функциональные группы, несущие как отрицательный, так и положительный заряды.

² GenBank® [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); 2013–2024. Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ Дата обращения: 09.01.2025.

³ Basic local alignment search tool® [Internet]. (MD): National Library of Medicine (US); 1990–2024. Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Дата обращения: 09.01.2025.

⁴ Аналит — целевое вещество для анализа.

⁵ Дериватизация — метод анализа, используемый в химии, который превращает анализируемое химическое соединение в продукт с похожей химической структурой, называемый дериватом.

⁶ Дериватизация — метод анализа, используемый в химии, который превращает анализируемое химическое соединение в продукт с похожей химической структурой, называемый дериватом.

作者简介

Varvara A. Zelenshchikova

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

编辑信件的主要联系方式.
Email: barbarazelen02@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9152-6379
SPIN 代码: 7929-8875
Researcher ID: LOS-7472-2024
俄罗斯联邦, 27 Baryshikha st, Moscow,125368

Maria V. Belova

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine

Email: belova_m_v@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0002-0861-5945
SPIN 代码: 6197-3906
Scopus 作者 ID: 23471675800

Dr. Sci. (Biology), Professor

俄罗斯联邦, 27 Baryshikha st, Moscow,125368; Moscow

Elizaveta V. Melnik

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: melnik_e_v_2@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0002-9727-9452
SPIN 代码: 5523-1359
Scopus 作者 ID: 57201116008

Cand. Sci. (Pharmacy)

俄罗斯联邦, 27 Baryshikha st, Moscow,125368

参考

补充文件