О возможности применения молекулярно-генетического идентификационного анализа для неопознанных останков тел, захороненных в период великой отечественной войны

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Молекулярно-генетические технологии, применяемые с целью индивидуализации биологических объектов, стали ключевым подходом в судебно-медицинской экспертной практике идентификации человеческих останков. Эффективность данного подхода значительно возросла за последние 25 лет благодаря внедрению методов генотипирования ядерной ДНК (полиморфных STR-локусов — коротких танденмных повторов) и митохондриальной ДНК. Фактически данные методы стали признанными международными стандартами в области идентификации человеческих останков [1].

С момента создания молекулярно-генетического отдела в ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России (РЦСМЭ) за более чем 30-летний период в рамках расследования уголовных дел, связанных с террористическими актами и чрезвычайным ситуациям с многочисленными человеческими жертвами, выполнено более 900 молекулярно-генетических экспертиз для идентификации тел погибших более чем в 20 чрезвычайных ситуациях, в том числе произошедших за пределами Российской Федерации [2, 3].

Кроме того, за последние годы в мировой практике и практике РЦСМЭ накоплен определенный опыт молекулярно-генетических исследований для идентификации человеческих останков времен Второй мировой войны [4, 5], Великой Отечественной войны (ВОВ), Первой советско-финской войны, а также боевых операций в Северо-Кавказском регионе в 1994–1996 гг. [6].

Для проведения молекулярно-генетических исследований эксгумированных останков из старых захоронений в РЦСМЭ поступают запросы от поисковых и общественных организаций, государственных структур и средств массовой информации. По результатам изучения документов в военных архивах организуются полевые экспедиции на места боев. В экспедиции принимают участие поисковые отряды и родственники погибших, которые пытаются установить точное место гибели военнослужащих. При проведении раскопок и эксгумации скелетированных останков обнаруживается перемешивание скелетов, что объясняется частым захоронением погибших бойцов в одной братской могиле, поэтому возможность на месте правильно разделить останки на тела является большой проблемой. Основной задачей экспертов-генетиков на этапе эксгумации и регистрации становится консультационная работа с поисковиками по изъятию наиболее пригодных и сохранившихся для анализа объектов (зубы и большие трубчатые кости) с соблюдением мер по предотвращению контаминаций, а также их правильная упаковка с целью соблюдения условий хранения и транспортировки. После предоставления биологических объектов в лабораторию следует этап молекулярно-генетического идентификационного исследования. По завершении ДНК-исследования результаты оформляются в виде заключения специалиста, направляются организаторам и являются основанием для проведения заключительных мероприятий по захоронению останков.

Цель исследования — изучение и обобщение материалов судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз, проведенных в РЦСМЭ в рамках идентификации жертв ВОВ на территории Российской Федерации, для оценки перспектив и возможностей применения молекулярно-генетического идентификационного анализа для неопознанных останков тел, захороненных в 1939–1945 гг.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Выполнено обзорное исследование заключений судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз и экспертных исследований, проведенных в РЦСМЭ, в которых осуществлялась идентификация жертв ВОВ, обнаруженных на территории Российской Федерации.

Выборку составили судебно-медицинские экспертизы, проведенные за 15-летний период (с 2006 по 2021 г.) — в общей сложности 30 заключений. Изучены материалы и обстоятельства дела; систематизированы количество объектов и их характер, применяемые аналитические методы и результаты молекулярно-генетической идентификации.

Во всех экспертизах объектом являлись эксгумированные скелетированные останки, которые представлены в фрагментарном виде — костные фрагменты и зубы. Референтные образцы — это биологические образцы от живых лиц (кровь, буккальный эпителий).

Стандартная технологическая процедура молекулярно-генетического идентификационного исследования — сложный многостадийный процесс, включающий в себя несколько этапов (рис.).

 

Рис. Стандартный технологический процесс молекулярно-генетического идентификационного исследования. ПЦР/РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Fig. Standard workflow for molecular genetic identification study. ПЦР/РВ — real-time polymerase chain reaction.

 

В зависимости от этапов молекулярно-генетического исследования применяли разные материалы и методы:

1) на этапе пробоподготовки это были осмотр и фотографирование объектов, очистка, измельчение костной ткани — получение костного порошка с использованием напильника или гомогенизатора TissueLyser II (QIAGEN, Германия);

2) выделение ДНК из костных фрагментов и образцов сравнения проводили с помощью наборов специализированных реагентов для костной ткани и роботизированных станций, выпускаемых производителями Applied Biosystems (США), Promega Corporation (США) и QIAGEN (Германия);

3) для анализа матричной активности ДНК в полученных препаратах использовали системы количественной ПЦР-амплификации ДНК серии Quantifiler^® DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США), PowerQuant^TM System (Promega, США) на специализированных амплификаторах QuantStudio^TM 5 Real-Time PCR System, ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США);

4) генотипирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК и локусов ГВС1 и ГВС2 митохондриальной ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием энзиматической амплификации мультилокусных панелей производителей Promega Corporation (США), Applied Biosystems (США), QIAGEN (Германия), в том числе для деградированной ДНК (во всех случаях) с использованием специализированных амплификаторов Applied Biosystems (США);

5) электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили на генетических анализаторах 3130, 3130XL, 3500 Applied Biosystems (США);

6) для анализа генетических данных применяли программное обеспечение GeneMapper v1.4, 1.6. (Applied Biosystems (США).

Для вероятностно-статистических расчетов значимости совпадения установленных генотипических признаков идентифицируемых объектов с образцами родственников (аутосомная ДНК, Y-ДНК и митохондриальная ДНК) использовали следующие параметрические значения из нижеуказанных источников:

• консервативные значения аллельных частот локусов, определенные в РЦСМЭ для выборки населения Российской Федерации с применением консервативной поправки, рекомендованной NRC II (США, 1996);
• консервативные значения аллельных частот исследованных STR-локусов аутосомной ДНК для населения Европы (литературные данные);
• значение частоты митотипа по международной базе данных EMPOP (Institute of Legal Medicine, Innsbruck Medical University, Инсбрук, Австрия);
• значение частоты гаплотипа Y-хромосомы по международной базе данных YHRD (Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences, Берлин, Германия).

Для анализа генетических данных в случае решения нестандартных случаев верификации родственных связей (бабушки-внуки, тети-племянники, двоюродные братья-сестры и пр.) применяли специализированное программное обеспечение GenoProof^® v. 1.3 (Qualitype, Германия), DNA-VIEW (C. Brenner, США), Converge^ТМ (Applied Biosystems, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сводные данные по количеству исследованных объектов и результатам идентификации представлены в табл.

 

Таблица. Результаты идентификации костных останков из захоронений жертв Великой Отечественной войны

Table. Identification of bone remains from the graves of victims of the Great Patriotic War

№ п/п	Год исследования	Число объектов	Число тел	Доказательность идентификации, число тел			Непригодность останков
				Положительных	Отрицательных	Всего
1	2007	12	5	4	1	5	0
2	2008	2	1	0	0	0	1
3	2013	3	3	0	3	3	0
4	2015	65	7	2	5	7	0
5	2016	10	3	0	2	2	1
6	2017	4	3	2	1	3	0
7	2018	7	3	1	2	3	0
8	2019	46	4	1	2	3	1
9	2020	198	105	0	104	104	1
10	2021	74	37	0	37	37	0
Итого		421	171	10	157	167	4

 

Успешность генотипирования составила 98%, из них положительная идентификация установлена для 10 (6%) человек, отрицательная — для 157 (94%). Непригодными для исследования были останки 4 скелетированных тел (2% от общего числа).

В 30% (9 из 30) случаев применяли схемы непрямой идентификации — сравнительное исследование идентифицируемых с заявленными родственниками путем биостатистического анализа, основанного на вероятностно-статистическом анализе характера совпадения аллельных состояний полиморфных локусов аутосомной ДНК, а также путем прямого сравнительного анализа полиморфизма ДНК Y-хромосомы и митохондриальной ДНК. Доказательность положительной идентификации находилась в вероятностном диапазоне 99,50–99,99999%.

Для полученных генотипических характеристик в обязательном порядке проводили контрольное сравнение с генотипами лиц, принимавших участие в манипуляциях с объектами экспертизы в ходе выполнения экспертных действий (экспертный и лаборантский персонал, медрегистраторы и др.), для исключения возможности ошибок, обусловленных контаминационными артефактами. Таких ошибок не выявлено. Для выполнения описанного сравнительного анализа использовали контрольный массив генетических данных (генотипических характеристик) сотрудников РЦСМЭ, сформированный для целей верификации результатов экспертных исследований, выполняемых в рамках производства молекулярно-генетических экспертиз.

ОБСУЖДЕНИЕ

Эксгумированные останки из старых захоронений представляются на исследование в скелетированном фрагментарном виде — это костные фрагменты и зубы. Данный вид объектов, как наименее подверженных деструктивным изменениям, позволяет надеяться на возможность сохранения и экстрагирования ДНК в деградированных образцах. В то же время воздействие негативных факторов (время, физико-химическое состояние почвы в захоронениях, микробная среда, ингибирующие примеси) ограничивает исследование и вынуждает искать и применять современные и оптимизированные методы для исследования ДНК из костных объектов.

Другой аспект идентификации касается применения молекулярно-генетического сравнительного анализа среди родственников погибших. В связи с отсутствием референтных образцов от самих погибших, а часто и прямых родственников уровня родитель–ребенок молекулярно-генетические экспертизы, по сути, становятся экспертизой непрямого родства: необходимо установить происхождение останков опосредованно, т. е. путем установления родства между предполагаемыми дальними родственниками, например, такими как внуки, племянники и др. Для решения этого вопроса на начальном этапе работы проводят структурный анализ заявленных родственных связей лиц, привлеченных к участию в экспертизе, и оценку их аналитической приемлемости для целей молекулярно-генетической верификации родства. Выполненная формализация заявленных родственных отношений между всеми обследуемыми лицами и аналитическая реконструкция заявленной родословной позволяет определить возможные способы молекулярно-генетической верификации частных версий предполагаемых родственных отношений и уже затем — общий поэтапный алгоритм всего исследования.

В большинстве случаев установить родственные отношения заявленных родственников возможно путем биостатистического анализа, основанного на вероятностно-статистическом анализе характера совпадения аллельных состояний полиморфных локусов аутосомной ДНК, а также путем прямого сравнительного анализа полиморфизма ДНК Y-хромосомы и митохондриальной ДНК.

Подобные молекулярно-генетические экспертизы, по сути, являются экспертизами отдаленного родства. В подобных случаях можно говорить о принципиальной возможности выполнения экспертного исследования, но его реальный результат прогнозировать трудно. Большое значение имеет то, какая именно степень родства проверяется, и какие именно генотипические признаки будут установлены в исследуемых объектах (они могут быть относительно распространенными, а могут быть редкими). В случае дальнего родства и наличия часто встречающихся признаков существует объективная перспектива того, что доказательственное значение результатов исследования может оказаться относительно невысоким, т. е. недостаточным для формулирования обоснованного экспертного вывода. Предсказать же заранее подобные ситуации невозможно, поскольку выяснить генотипические характеристики лиц, в отношении которых проводится экспертиза, и их перспективность для анализа можно только в ходе непосредственного выполнения экспертного исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические исследования являются высокоэффективным инструментом для идентификации останков жертв природных и техногенных катастроф, военных конфликтов и иных чрезвычайных ситуаций. Результаты многочисленных успешно выполненных судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований, проведенных в РЦСМЭ в рамках идентификации жертв ВОВ, наглядно демонстрируют эти возможности.

В то же время надо подчеркнуть, что экспертная идентификация останков жертв давних военных конфликтов сопряжена с большими потенциальными трудностями. В связи с отсутствием референтных образцов от самих погибших, прямых родственников на уровне родитель–ребенок, а также по причине давности событий подобные экспертизы, по сути, становятся экспертизами непрямого родства: необходимо идентифицировать останки опосредованно — путем установления родства между предполагаемыми дальними родственниками, например, такими как внуки, племянники и др. При наличии таких родственников-референтов полученные генотипические характеристики аутосомной ДНК, ДНК Y-хромосомы и митохондриальной ДНК неустановленных тел в принципе могут быть использованы для выполнения экспертного идентификационного исследования, направленного на их идентификацию и установление личности.

Однако такой тип экспертиз относится к категории особо сложных молекулярно-генетических исследований и в зависимости от обстоятельств требует применения особых методических приемов и аппаратных средств, а также использования расширенных панелей аналитических тест-систем. Кроме того, в настоящее время отсутствуют утвержденные единые методики исполнения подобных экспертиз. Эти обстоятельства необходимо учитывать. Молекулярно-генетические исследования по идентификации человеческих останков из старых захоронений должны проводиться в лабораториях, оснащенных высокотехнологичным оборудованием, программными средствами, позволяющими обеспечить доказательность анализа отдаленного родства, персоналом нужной компетенции и квалификации и прочими необходимыми условиями.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Участие авторов • Author contribution

Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Аll authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования • Funding source

Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

The study had no sponsorship.

Конфликт интересов • Competing interests

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no apparent or potential conflicts of interest.

Об авторах

Елена Юрьевна Земскова

Российский центр судебно-медицинской экспертизы

Автор, ответственный за переписку.
Email: zemskova@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-2669-0877

к.м.н.

Россия, 125284, Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13

Павел Леонидович Иванов

Российский центр судебно-медицинской экспертизы

Email: dna@rc-sme.ru
ORCID iD: 0000-0002-4753-3125

д.б.н., профессор

Россия, 125284, Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13

Список литературы

Дополнительные файлы