Digital comparative taxonomic analysis of diatom communities for determining the site of drowning: a technical report

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Установление места утопления является одной из важнейших и одновременно сложных задач судебно-медицинской диагностики данного вида смерти [1–3]. На практике решение указанной задачи основывается на сравнительном исследовании сообществ диатомовых водорослей (планктона), извлечённых из внутренних органов трупа и из предполагаемого водоёма [4–6]. Однако, несмотря на десятилетия применения, методология сравнительного таксономического анализа в судебно-медицинской альгологии остаётся недостаточно формализованной и в значительной степени субъективной [3, 7, 8]. Существующие экологические подходы к анализу биоразнообразия [например, кластерный анализ, многомерное шкалирование, анализ сходства (Analysis of Similarities, ANOSIM)] рассчитаны на сравнение множества проб и зачастую неприменимы ввиду требования к большому размеру выборки или избыточны для принципиальной задачи экспертизы — парного сравнения образцов: контрольного (из водоёма) и исследуемого (трупного) [9]. Рассчитываемые отдельные экологические индексы, несмотря на их значимость для интерпретации результатов диатомового анализа, при самостоятельном применении не позволяют сделать однозначный количественный вывод о происхождении экстрактов планктона и служат лишь вспомогательным инструментом, не давая интегральной оценки сходства, учитывающей всю структуру сообщества [10–12]. На практике в большинстве случаев экспертное заключение вообще традиционно опирается лишь на качественную визуальную оценку сходства сообществ диатомей, что неизбежно влечёт за собой риск интерпретационной вариабельности и затрудняет статистическое обоснование выводов.

Указанное методологическое ограничение обусловливает необходимость разработки специализированного аналитического протокола, отвечающего специфике судебно-медицинских исследований. Он должен решать три основные задачи.

• Во-первых, обеспечивать количественную оценку сходства обнаруженных диатомовых сообществ с помощью объективных метрик, таких как дистанции Брея–Кёртиса и Хелленджера, учитывающих не только наличие, но и обилие таксонов [13, 14].
• Во-вторых, включать анализ структуры сообщества: выявление и сравнение ядра доминирующих таксонов, а также оценку индикаторных таксонов (например, по адаптированной логике метода Дюфрена–Лежандра) и общей стабильности, где интерпретация результатов должна быть напрямую калибрована на задачу установления общего источника происхождения проб [15–20].
• В-третьих, методология должна предусматривать статистическую валидацию результатов парного сравнения, позволяя вычислять значимость наблюдаемых различий при минимальном количестве сравниваемых образцов [11, 21].

Потребности практики также диктуют необходимость создания специализированного программного обеспечения, реализующего данный метод сравнительного таксономического анализа. Экспертам-альгологам необходим доступный и интуитивно понятный инструмент, который автоматизирует ввод данных и сложные расчёты, обеспечит единообразие процедуры анализа и сформирует структурированный отчёт. Разработка такого программного обеспечения не только стандартизирует исследовательский процесс, минимизируя человеческую ошибку, но и сделает передовые методы многомерной статистики доступными для рутинной экспертной работы, что представляется важным шагом на пути цифровизации и объективизации судебно-медицинского экспертного заключения [22, 23].

Таким образом, разработка формализованного метода и программного инструмента для парного сравнительного таксономического анализа при утоплении является решением актуальной научно-практической задачи, направленным на повышение доказательной силы и воспроизводимости диатомологического метода в судебной медицине.

ЦЕЛЬ

Разработка формализованного метода цифрового парного сравнительного таксономического анализа диатомового планктона и его реализация в виде кроссплатформенного веб-приложения для судебно-медицинской практики.

МЕТОДЫ

Работа представляет разработку и реализацию в виде веб-приложения формализованного метода парного сравнительного таксономического анализа векторов данных о диатомовых сообществах экстрактов двух образцов: контрольного, извлечённого из предполагаемого водоёма, и исследуемого — из трупного биоматериала. Протокол метода, определяемого как цифровой сравнительный таксономический анализ (ЦСТА), представляет последовательность вычисления взаимодополняющих метрик, объединённых в три аналитических блока:

• общее сходство (несходство Брея–Кёртиса, дистанция Хелленджера, бутстрэп-тест значимости);
• структура доминирования (определение доминирующих таксонов по порогу или топ-k, индекс доминирования Симпсона, относительная разница в доминировании, ранговые корреляции);
• стабильность и индикаторность (адаптированные метрики Дюфрена–Лежандра для каждого таксона с последующей агрегацией в композитный индекс индикаторности и общий индекс стабильности).

Имитационное моделирование методом Монте-Карло

Для обоснования пороговых значений метрик протокола ЦСТА и оценки их диагностической эффективности проведено имитационное моделирование методом Монте-Карло. Моделирование выполняли на языке Python 3 с использованием библиотек numpy, scipy.stats и matplotlib. Основной целью являлось получение эмпирических распределений каждой метрики для двух сценариев:

• H₀ (нулевая гипотеза) — пробы происходят из одного и того же диатомового сообщества (одного водоёма);
• H₁ (альтернативная гипотеза) — пробы происходят из статистически разных сообществ (разных водоёмов).

Относительные обилия генерировали с использованием логнормального распределения, параметр формы которого определяли коэффициентом выравненности:

$\sigma =1/evenness$, (1)

где σ — параметр формы логнормального распределения; evenness — параметр выравненности.

Параметры моделирования:

• общее число потенциально возможных таксонов в водоёме принято равным 100;
• количество активных таксонов в каждом сообществе случайным образом выбирали из диапазона от 10 до 50, неактивные таксоны имели нулевую вероятность встречаемости;
• диапазон варьирования параметра выравненности составлял от 0,3 до 3,0;
• для учёта эффекта редкости введён порог редкости 0,001: если расчётная вероятность таксона оказывалась ниже этого порога, таксон считали необнаруженным, а его вероятность обнулялась перед извлечением пробы;
• для моделирования случайной вариации при отборе проб использовали мультиномиальное распределение;
• для учёта возможных ошибок идентификации и подсчёта введён параметр ошибки пробы, равный 0,01, при срабатывании которого к счётчику таксона случайным образом добавлялось или вычиталось от 1 до 4 створок;
• в сценарии H₀ объёмы проб фиксированы и составляли 1000 особей в каждой пробе;
• в сценарии H₁ объёмы проб для каждого сообщества выбирали случайным образом из диапазона от 200 до 2000.

Генерация данных

Для сценария H₀ генерировали одно эталонное сообщество с параметром evenness=1,0 (умеренная выравненность). Из этого сообщества с использованием вышеописанных параметров извлекали 10 000 пар проб, имитирующих случайную вариацию при повторном отборе из одной генеральной совокупности.

Для сценария H₁ на каждой итерации независимо генерировали два сообщества с параметрами evenness, равномерно распределёнными в диапазоне [0, 3; 3, 0]. Из каждого сообщества извлекали по одной пробе со случайным объёмом из диапазона [200; 2000] также с учётом редкости и ошибок. Всего генерировали 10 000 пар проб, отражающих различия между разными водоёмами.

Выделение доминирующих таксонов

Для всех метрик, использующих понятие «множество доминирующих таксонов» (индексы Жаккара, Сёренсена–Дайса, процент совпадения, стабильность присутствия и производные композитные индексы), применяли метод «топ-3» — три таксона с наибольшим относительным обилием в пробе.

Расчёт метрик и определение пороговых значений

Для каждой сгенерированной пары проб вычисляли все метрики, включённые в протокол ЦСТА. После завершения моделирования для каждой метрики построены эмпирические распределения при H₀ и H₁.

Пороговые значения, разделяющие области подтверждения H₀ и H₁, устанавливали таким образом, чтобы специфичность (доля проб H₀, правильно классифицированных как «один водоём») и чувствительность (доля проб H₁, правильно классифицированных как «разные водоёмы») составляли не менее 95% для каждой метрики. Для метрик, где большее значение соответствует большему сходству, за нижнюю границу «высокого сходства» принимался 5-й процентиль распределения H₀, а за верхнюю границу «низкого сходства» — 95-й процентиль распределения H₁. Для метрик, где большее значение соответствует большему различию, за верхнюю границу «высокого сходства» принимался 95-й процентиль распределения H₀, а за нижнюю границу «низкого сходства» — 5-й процентиль распределения H₁. Если распределения H₀ и H₁ перекрывались настолько, что указанные условия не могли быть выполнены одновременно, метрику признавали недостаточно информативной и исключали из итоговой шкалы интерпретации.

Языки программирования и технологии

Код онлайн-приложения написан на JavaScript с использованием библиотеки React, а также на Python 3 с использованием фреймворка Django и Django REST Framework для обеспечения API расчётных функций. В коде применяются библиотеки:

• numpy — для векторных вычислений;
• scipy — для статистических расчётов (ранговые корреляции);
• plotly — для визуализации графиков.

Приложение совместимо с операционными системами Windows, Linux, Android и iOS, запускается в современных веб-браузерах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При выполнении настоящей работы разработан протокол ЦСТА, адаптированный для задачи идентификации места утопления. Протокол включает многомерный статистический анализ на основе бутстрэп-процедуры с использованием дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера, а также комплексный анализ доминирующих таксонов и индикаторных видов. Подробная характеристика вычисляемых метрик приведена ниже.

1. Метрики дистанций (несходства)

Основными метриками ЦСТА являются оценки дистанций (несходства) составов таксонов диатомового планктона, обнаруженных при альгологическом исследовании образцов среды утопления и трупного материала, в частности несходство Брея–Кёртиса и дистанция Хелленджера [13, 14]. Обе метрики измеряют степень перекрытия видовых составов планктона между образцами и являются композиционными, поскольку основываются на процентных соотношениях таксонов, вследствие чего нечувствительны к пропорциональным изменениям их абсолютных величин. Оценки обеих метрик могут принимать значения от 0 до 1, при этом 0 означает идентичный состав, а 1 — отсутствие общих таксонов.

В рамках решаемой задачи формулы указанных метрик принимают следующий вид:

$B{C}_{ij}=1-\sum _{k=1}^n\min \left(p_{ik},p_{jk}\right),$, (2)

где BC_ij — несходство Брея–Кёртиса между таксономическими составами образцов i и j; p_ik, p_jk — доли таксона k в образцах i и j; n — количество таксонов; min — минимальное значение в паре;

$H_{ij}=\sqrt{\sum _{k=1}^n{\left(\sqrt{p_{ik}}-\sqrt{p_{jk}}\right)}^2}$, (3)

где H_ij — ненормированная дистанция Хелленджера между таксономическими составами образцов i и j; p_ik, p_jk — доли таксона k в образцах i и j; n — количество таксонов.

2. Анализ доминирующих таксонов

2.1. Определение доминирующих таксонов

Базовым компонентом анализа доминирующих таксонов, в значительной степени определяющим его результаты, является способ установления множества доминирующих таксонов. Стандартный подход к определению элементов данного множества сводится к произвольному выбору порога доминирования. Таксоны, относительные обилия которых достигают или превышают выбранный порог, идентифицируют как доминирующие. Помимо указанного способа, в рамках ЦСТА также реализован альтернативный метод определения множества доминирующих таксонов, основанный на выделении топ-k таксонов.

2.2. Формулы сходства доминирующих таксонов

Стандартный подход к оценке сходства доминирующих таксонов заключается в вычислении метрик Жаккара и Сёренсена–Дайса [15–17]. Индекс Жаккара оценивают как:

$J=\frac{\left|\text{A}\cap \text{B}\right|}{\left|\text{A}\cup \text{B}\right|}$, (4)

где J — индекс Жаккара; А и В — множества доминирующих таксонов в каждом из двух образцов; $\left|\text{A}\cap \text{B}\right|$ — количество общих доминирующих таксонов; $\left|\text{A}\cup \text{B}\right|$ — количество таксонов в объединении множеств A и B [15].

Коэффициент Сёренсена–Дайса вычисляют по формуле [16, 17]:

$SD=\frac{2\left|\text{A}\cap \text{B}\right|}{\left|\text{A}\right|+\left|\text{B}\right|}$, (5)

где SD — метрика Сёренсена–Дайса; $\left|\text{A}\cap \text{B}\right|$ — количество общих доминирующих таксонов; $\left|\text{A}\right|$ и $\left|\text{B}\right|$ — количество элементов во множествах А и В.

Помимо указанных метрик в качестве естественного развития заложенных в них идей в вычислительный алгоритм ЦСТА включена интуитивно понятная и легко интерпретируемая метрика — процентное совпадение доминирующих таксонов:

$O=\frac{\left|\text{A}\cap \text{B}\right|}{\min \left(\left|\text{A}\right|,\left|\text{B}\right|\right)}\times 100\%$, (6)

где О — показатель совпадения, %; $\left|\text{A}\cap \text{B}\right|$ — количество общих доминирующих таксонов; min — минимальное значение в паре; $\left|\text{A}\right|$ и $\left|\text{B}\right|$ — количество элементов во множествах А и В.

2.3. Анализ ранговой корреляции доминирования

Помимо перечисленных метрик структуры доминирования ЦСТА также выполняют сравнение рангов обилий таксонов диатомового планктона в двух образцах путём вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена и Кендалла.

Коэффициент ранговой корреляции Спирмена оценивается по формуле:

$\rho =1-\frac{6{\displaystyle \sum d_i^2}}{n\left(n^2-1\right)}$, (7)

где ρ — обозначение коэффициента Спирмена; d_i — разность рангов таксона i в образцах А и В; n — количество таксонов.

Коэффициент ранговой корреляции Кендалла вычисляется иначе:

$\tau =\frac{2\left(P-Q\right)}{n\left(n-1\right)}$, (8)

где τ — обозначение коэффициента Кендалла; P — количество согласованных пар рангов; Q — количество несогласованных пар; n — общее количество пар рангов.

Диапазоны значений обоих коэффициентов могут изменяться от −1 до 1, однако в контексте сравнения двух проб из одного водоёма отрицательные значения коэффициентов маловероятны, поскольку сравниваются ранжировки одних и тех же таксонов.

2.4. Индекс доминирования Симпсона

Ещё одной метрикой, измеряющей доминирование и реализованной в вычислительном алгоритме ЦСТА, является индекс Симпсона, определяемый по формуле:

$D=\sum p_i^2$, (9)

где D — выборочная оценка параметра λ Симпсона; p_i — относительное обилие таксона i [18]. Параметр λ Симпсона представляет меру концентрации для бесконечной популяции, в которой особи распределены по группам, и обозначает вероятность, что две особи, случайно и независимо выбранные из популяции, принадлежат к одной и той же группе [18].

Индекс Симпсона измеряет доминирование: чем значение этой метрики больше, тем меньше разнообразие таксонов в экстракте планктона. Для количественного сравнения индексов Симпсона для двух образцов протокол ЦСТА с помощью масштабирующего множителя, представляющего максимально наблюдаемое доминирование в образцах, предполагает вычисление нормированного абсолютного различия в степени доминирования:

$\Delta D=\frac{\left|D_1-D_2\right|}{\max \left(D_1,D_2\right)}$, (10)

где ΔD — относительная разница в доминировании; D₁ и D₂ — индексы Симпсона для образцов 1 и 2; max — максимальное значение в паре.

Диапазон значений параметра ΔD варьирует от 0 до 100%, при этом идентичной структуре доминирования соответствует значение 0%, а максимально возможному различию, когда в одном сообществе наблюдается полное доминирование, а в другом — равномерное распределение таксонов — 100%.

3. Анализ индикаторных видов

Поскольку для сравнения двух образцов классический анализ индикаторных видов Дюфрена–Лежандра неприменим [19, 20], в ЦСТА предусмотрены адаптированные подходы, заключающиеся в вычислении метрик относительной разницы обилий, стабильности присутствия, стабильности обилий и композитного индекса индикаторности.

3.1. Относительная разница обилий

Данная метрика показывает, насколько различается обилие конкретного таксона между двумя образцами:

$R{D}_i=\frac{\left|p_{iA}-p_{iB}\right|}{\max \left(p_{iA},p_{iB}\right)}\times 100\%$, (11)

где RD_i — относительная разница обилий; p_iA и p_iB — относительные обилия таксона i в образцах А и В; max — максимальное значение в паре. Максимума данный показатель достигает при отсутствии таксона в одном из образцов.

3.2. Стабильность присутствия

В протоколе ЦСТА используется расширенная формула стабильности присутствия, дающая три возможных значения вместо двух стандартных и позволяющая перейти от бинарной логики (есть/нет) к более тонкой градации, что особенно полезно для таксонов с низкой или переменной встречаемостью. Кроме того, предусмотрена дополнительная возможность выбора одного из двух подходов к вычислению данной метрики.

Первый подход строится на анализе порога встречаемости. В соответствии с алгоритмом оценки данной метрики таксон считается «присутствующим», если его относительное обилие превышает установленный порог, например 1 или 5%. Тогда индикатору присваивается значение 1, если таксон присутствует в обоих образцах (его обилие в каждом из них превышает установленный порог). Если таксон присутствует только в одном из двух образцов (его обилие выше установленного порога в одном и ниже в другом), то индикатору присваивается значение 0,5. Индикатор равен 0, если таксон отсутствует в обоих образцах (его обилие в каждом из них ниже установленного порога).

Альтернативный подход основывается на выборе вместо фиксированного порога топа первых k таксонов. Это более адаптивный подход, подстраивающийся под уровень доминирования, характерный для каждого конкретного образца. Алгоритм метода включает выполнение следующих операций:

• определение значения k и топа k самых обильных таксонов в каждом образце;
• оценка вхождения каждого таксона из имеющегося набора данных в топ-k каждого из двух образцов;
• присвоение индикатору значения 1, если таксон входит в топ-k обоих образцов, значения 0,5 — в топ-k только одного из двух образцов, и значения 0 — таксон не входит в топ-k ни одного из двух образцов.

Выбор значения k является ключевым в реализации второго подхода. Это объясняется тем, что слишком маленькое k (например, 3) может не учитывать важные таксоны, а слишком большое (например, 25) — нивелировать сам принцип «доминирования». Значение k целесообразно выбирать на основе кумулятивной кривой доминирования, принимая за него количество таксонов, численность которых составляет 80% общего количества обнаруженных диатомей.

Высокая стабильность (SP_i=1) означает, что сообщество в обоих экстрактах планктона определяют одни и те же доминирующие таксоны. Умеренная стабильность (SP_i=0,5) свидетельствует о доминировании некоторых таксонов лишь в одном из образцов, что указывает на начальные различия в структуре обнаруженных в них диатомовых сообществ. Нулевая стабильность (SP_i=0) отдельных таксонов доказывает, что они не определяют структуру диатомовых сообществ ни в одном из образцов.

3.3. Коэффициент стабильности обилий

Метрика показывает степень сходства обилий таксона между образцами:

$S{C}_i=\frac{\min \left(p_{iA},p_{iB}\right)}{\max \left(p_{iA},p_{iB}\right)}$, (12)

где SC_i — степень сходства обилий; p_iA и p_iB — относительные обилия таксона i в образцах А и В; max — максимальное значение в паре; min — минимальное значение в паре. Это наиболее объективная метрика для таксонов со средним обилием, диапазон возможных значений которой варьирует от 0 до 100%.

3.4. Композитный индекс индикаторности для двух образцов

Метрика является интегральным индексом, объединяющим значения трёх индикаторов по отдельным таксону — относительной разницы обилий, стабильности присутствия и стабильности обилий:

$In{d}_i=\frac{\left(1-R{D}_i\right)+S{C}_i+S{P}_i}{3}\times 100\%$, (13)

где Ind_i — композитный индекс индикаторности; RD_i — относительная разница обилий; SC_i — степень сходства обилий; SP_i — стабильность присутствия. Область значений композитного индикатора также варьирует от 0 до 100%.

3.5. Общий индекс стабильности сообщества

Поскольку композитный индекс индикаторности рассчитывается в отношении каждого отдельного таксона, в протокол ЦСТА включён расчёт общего индекса стабильности по всем таксонам:

$IS=\frac{{\displaystyle \sum \left(In{d}_i\times p_i\right)}}{{\displaystyle \sum p_i}}$, (14)

где IS — общий индекс стабильности; Ind_i — композитный индекс индикаторности; p_i — относительное обилие таксона i.

Общий индекс стабильности носит интегральный характер, обобщая данные композитного индекса индикаторности по всем таксонам. Он чувствителен к сдвигам в ядре сообщества, поскольку придаёт больший вес изменениям в обильных видах.

Имитационное моделирование методом Монте-Карло с контролируемыми уровнями специфичности и чувствительности (≥95%) позволили разработать шкалу интерпретации значений метрик ЦСТА, представленную в табл. 1.

4. Бутстрэп-процедура

Комплекс вышеперечисленных метрик представляет мощный вспомогательный показатель, но не самостоятельный критерий, дающий количественную оценку вероятности происхождения экстрактов планктона из одного водоёма. Именно поэтому в протокол ЦСТА включён наиболее важный бутстрэп-компонент, позволяющий решить указанную задачу. Суть последней сводится к тому, что у эксперта есть два вектора (пробы), каждый из которых описывает количество особей для n таксонов. Необходимо проверить гипотезы:

• H₀ (нулевая гипотеза): пробы взяты из одного диатомового сообщества (одного водоёма с одинаковой структурой сообщества), различия между ними случайны и обусловлены лишь естественной изменчивостью и ошибками взятия пробы и пробоподготовки;
• H₁ (альтернативная гипотеза): пробы взяты из статистически разных диатомовых сообществ (из разных водоёмов).

Наиболее эффективное решение указанной задачи достигается с помощью бутстрэппинга, в рассматриваемом контексте представляющего метод оценки значимости различий между двумя экологическими пробами путём многократной генерации псевдовыборок из объединённого пула данных, моделирующего гипотетический «общий водоём», и сравнения наблюдаемых дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера с распределением данных метрик, полученных на этих псевдовыборках. Таким образом, рассматриваемый метод является гибридным подходом, сочетающим идею нулевой гипотезы (один водоём) с бутстрэп-методологией генерации данных, что особенно эффективно при таком малом числе образцов.

Пошаговый алгоритм бутстрэп-процедуры включает следующие этапы.

• Шаг 1. Расчёт наблюдаемых дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера между двумя исходными пробами.
• Шаг 2. Создание общего пула данных как взвешенного среднего нормализованных векторов обилий обеих проб с учётом их общего количества особей:

${\mathbf{p}}_{\mathit{0}}=\frac{n_A\mathit{\times }{p}_A\mathit{+}{n}_B\mathit{\times }{p}_B}{n_A\mathit{+}{n}_B}$, (15)

где р₀ — вектор оценок вероятностей встречи каждого таксона в гипотетической общей популяции, из которой, в соответствии с нулевой гипотезой, происходят обе пробы; n_A — общее количество особей в пробе A; n_В — общее количество особей в пробе В;

${\mathbf{p}}_A=\left(\frac{a_1}{n_A},\frac{a_2}{n_A},\cdots \frac{a_m}{n_A}\right)$, (16)

где p_A — вектор относительных обилий таксонов в пробе A, получаемый нормированием вектора количеств a на общее число особей n_A в этой пробе; a=(a₁, a₂,…,a_m) — вектор количеств особей по таксонам в пробе A;

${\mathbf{p}}_B=\left(\frac{b_1^{}}{n_B},\frac{b_2^{}}{n_B},...\frac{b_m^{}}{n_B}\right)$, (17)

где p_B — вектор относительных обилий таксонов в пробе B, получаемый нормированием вектора количеств b на общее число особей n_B в этой пробе; b=(b₁, b₂,…,b_m) — вектор количеств особей по таксонам в пробе B.

• Шаг 3. Генерация путём случайного извлечения из общего пула двух псевдовыборок, по размеру равных исходным пробам. При этом для каждой бутстрэп-итерации t (t=1, 2,…,1000) генерируются два случайных вектора ${\mathbf{c}}_A^{\left(t\right)}$ и ${\mathbf{c}}_B^{\left(t\right)}$ с помощью мультиномиального распределения таким образом, что каждый вектор ${\mathbf{c}}_A^{\left(t\right)}$ и ${\mathbf{c}}_B^{\left(t\right)}$ представляет результат «случайного отбора» n_A и n_B особей соответственно из общей популяции с вероятностями таксонов, заданными вектором р_0. Для последующего расчёта дистанций векторы количеств нормализуют, чтобы получить векторы относительных обилий для псевдовыборок:

${\mathbf{p}}_A^{\left(t\right)}=\frac{{\mathbf{c}}_A^{\left(t\right)}}{n_A}$, (18)

где ${\mathbf{p}}_A^{\left(t\right)}$ — псевдовыборка для пробы А; ${\mathbf{c}}_A^{\left(t\right)}$ — случайный вектор для пробы А; n_A — общее количество особей в пробе A; и

${\mathbf{p}}_B^{\left(t\right)}=\frac{{\mathbf{c}}_B^{\left(t\right)}}{n_B}$, (19)

где ${\mathbf{p}}_B^{\left(t\right)}$ — псевдовыборка для пробы B; ${\mathbf{c}}_B^{\left(t\right)}$ — случайный вектор для пробы B; n_B — общее количество особей в пробе B.

• Шаг 4. Оценка бутстрэп-дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера для полученной пары $\left({\mathbf{p}}_A^{\left(t\right)}, {\mathbf{p}}_B^{\left(t\right)}\right)$ псевдовыборок по тем же формулам, что и для исходных данных.
• Шаг 5. Повторение процесса генерации бутстрэп-выборок, описанного в шагах 3 и 4, 1000 раз с получением распределения дистанций, которые можно ожидать, если нулевая гипотеза верна (т. е. пробы действительно из одного водоёма).
• Шаг 6. Оценка сглаженного уровня значимости:

$p=\frac{1+m}{1000+1}$, (20)

где p — уровень значимости; m — количество бутстрэп-итераций, в которых смоделированная дистанция больше или равна аналогичной наблюдаемой.

Малое значение уровня значимости предполагает, что столь большая наблюдаемая дистанция очень маловероятна, если бы пробы были из одного водоёма. В этом случае нулевую гипотезу отвергают и делают вывод, что различия по таксономическому составу экстрактов планктона статистически значимы. Если уровень значимости велик, нулевую гипотезу не отвергают, следовательно, наблюдаемую дистанцию легко можно получить случайно из одного сообщества (водоёма).

На основе изложенного протокола ЦСТА создано бесплатное кроссплатформенное онлайн-приложение Qualitative Dual Sample Taxa Analyzer¹, доступное по URL-адресу². Программа представляет научно-исследовательский прототип, реализующий предложенный метод ЦСТА, и предназначена для использования экспертами в качестве вспомогательного аналитического инструмента (калькулятора). Её применение в практической деятельности осуществляют по усмотрению эксперта для объективизации и углублённого анализа результатов диатомологического исследования.

Приложение предоставляет гибкий ввод данных, который может быть выполнен как автоматически после загрузки XML-файлов, полученных при разметке SVS-сканов экстрактов планктона, так и путём ручного выбора числа актуальных таксонов и самостоятельного заполнения пользователем соответствующих текстовых полей. Разметку SVS-сканов экстрактов планктона также можно выполнить вручную или с помощью искусственных нейросетей. Приложение рассчитывает все метрики ЦСТА с формированием структурированного отчёта, а также визуализирует результаты бутстрэппинга.

Пример

При исследовании цифровых сканов минерализатов, полученных методом экстракции перекисью водорода из 40 мл воды предполагаемого водоёма утопления и 2 мл жидкости клиновидной пазухи трупа, обнаружены соответственно 11 722 и 446 особей диатомового планктона, родовой состав которого приведён в табл. 2. Необходимо доказать или опровергнуть происхождение обоих экстрактов планктона из одного сообщества (водоёма), приняв порог доминирования равным 0,02, а топ доминирующих таксонов — 3.

Приложение Qualitative Dual Sample Taxa Analyzer по приведённым данным позволяет вычислить все метрики ЦСТА как в отношении каждого таксона (см. табл. 2), так и диатомовых сообществ обоих экстрактов (табл. 3). Применение разработанной шкалы интерпретации (см. табл. 1) показало, что большинство метрик уверенно подтверждают гипотезу о происхождении экстрактов из одного водоёма, поскольку их значения находятся в области H₀ с гарантированной специфичностью не менее 95%. Значения дистанции Хелленджера и ранговых корреляций Спирмена и Кендалла оказались в неопределённой зоне, что не противоречит нулевой гипотезе, но указывает на необходимость комплексной оценки. Решающим аргументом в пользу H₀ стал бутстрэп-тест, показавший наблюдаемые различия, не превышающие ожидаемых при случайной вариации внутри одного сообщества (рис. 1). Таким образом, несмотря на отдельные отклонения, совокупность данных однозначно свидетельствует в пользу происхождения экстрактов из одного водоёма.

Рис. 1. Гистограммы дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера для 1000 бутстрэп-псевдовыборок, сгенерированных для данных из примера.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основных результатов

Разработан формализованный метод ЦСТА, направленный на устранение ключевых методологических ограничений в судебно-медицинской альгологии. Они связаны с отсутствием алгоритмов объективной интерпретации диатомологических тестов и статистического обоснования экспертных выводов относительно сходства диатомовых сообществ в экстрактах планктона из трупного биоматериала и предполагаемой среды утопления. Основным результатом стала не только теоретическая проработка протокола ЦСТА, но и его реализация в виде доступного веб-приложения. Для объективизации шкалы интерпретации метрик впервые применено имитационное моделирование методом Монте-Карло, позволившее установить статистически обоснованные пороговые значения с контролируемыми уровнями чувствительности и специфичности. Принципиальным преимуществом разработанной модели стал учёт широкого спектра факторов, приближающих симуляцию к реальным условиям судебно-медицинского анализа: переменное число активных таксонов, эффект редкости, ошибки идентификации и вариабельность объёмов проб. Это обеспечило высокую надёжность и практическую значимость полученных порогов.

Интерпретация результатов

Главной особенностью ЦСТА является создание методологии, адаптированной под специфическую задачу парного сравнения экстрактов планктона. Стандартные многомерные методы экологии для построения значимых моделей требуют множества проб из разных биотопов, что делает их неприменимыми в рутинной судебно-медицинской практике, где сравнивается всего два образца [9]. Предложенный протокол ЦСТА решает эту проблему путём комбинации взаимодополняющих метрик, каждая из которых применима для парного сравнения, и их статистической валидации через бутстрэп-тест.

Алгоритм ЦСТА заменяет субъективную визуальную оценку расчётом объективных, воспроизводимых величин. Ключевую роль играет использование дистанций Брея–Кёртиса и Хелленджера, которые, в отличие от простых индексов присутствия–отсутствия, интегрируют информацию об обилии таксонов, обеспечивая более тонкую и экологически обоснованную оценку общего сходства сообществ [13, 14].

Основополагающим элементом ЦСТА является внедрение процедуры бутстрэппинга для проверки значимости наблюдаемых дистанций. Этот подход позволяет ответить на вопрос, могли ли обнаруженные различия возникнуть случайно в условиях одного генерального сообщества, что предоставляет эксперту-альгологу ранее отсутствовавший в его арсенале статистически обоснованный критерий для принятия решения относительно происхождения диатомового планктона в трупном биоматериале.

Использование не какой-то одной, а системной комбинации метрик позволяет не только констатировать факт сходства или различия сравниваемых диатомовых сообществ, но и интерпретировать его природу [9, 24]. В частности, блок общего сходства даёт интегральную оценку и определяет степень сходства образцов в целом. Блок структуры доминирования смещает фокус на ядро сообщества, выявляя, совпадают ли доминирующие таксоны и их иерархия, что часто имеет решающее диагностическое значение. Блок стабильности и индикаторности позволяет оценить вклад каждого отдельного таксона в сходство или различие, выявляя потенциальные виды-индикаторы конкретного местообитания.

Для устранения субъективности при интерпретации численных значений метрик проведено имитационное моделирование методом Монте-Карло с учётом максимального числа реалистичных факторов. В модели варьировало число активных таксонов (от 10 до 50), что отражает естественную неполноту таксономических списков. Логнормальное распределение с регулируемой выравненностью (evenness от 0,3 до 3,0) позволило воспроизвести широкий спектр структур доминирования — от сообществ с резким преобладанием немногих видов до высокоравномерных. Порог редкости (0,001) имитировал ситуацию, когда редкие, но присутствующие в водоёме таксоны могут не попасть в пробу. Для моделирования случайной вариации при отборе проб использовали мультиномиальное распределение, являющееся стандартным инструментом для описания многомерных дискретных данных. Введение случайных ошибок идентификации и подсчёта (с вероятностью 0,01) позволило оценить устойчивость метрик к типичным погрешностям лабораторного этапа. Наконец, в сценарии H₁ варьировали объёмы проб (200–2000 особей), что соответствует реальному разбросу числа обнаруженных створок. Совокупность перечисленных усовершенствований делает разработанную модель наиболее адекватной реальным условиям судебно-медицинского диатомового анализа среди известных подходов.

Разработка веб-приложения, воспроизводящего протокол ЦСТА, решает несколько прикладных задач:

• стандартизации;
• доступности;
• документирования.

Использование программы гарантирует, что разными экспертами расчёт однотипных метрик будет проводиться по единому алгоритму, минимизируя технические ошибки и вариабельность. Веб-интерфейс, не требующий установки сложного программного обеспечения и глубоких знаний в программировании, делает передовые методы статистики доступными для любого эксперта-альголога. Автоматическая генерация отчёта, включающего все рассчитанные показатели и графики, создаёт прозрачную и проверяемую основу для экспертного заключения, соответствующего принципам доказательной медицины и требованиям судопроизводства.

Таким образом, представленный метод ЦСТА и его программная реализация являются шагом к созданию цифровой экосистемы для эксперта-альголога, которая будет включать инструменты для цифровой микроскопии, автоматической таксономии и статистического сравнения проб [10, 22, 23]. Интеграция таких инструментов в единый рабочий процесс — перспективное направление для полной цифровой трансформации судебно-медицинской диатомологии [8, 10, 25].

ОГРАНИЧЕНИЯ

Ограничения ЦСТА определяются его зависимостью от качества входных данных. Прежде всего ЦСТА малопригоден для сравнения экстрактов планктона из водоёма и извлечённых из так называемых закрытых органов — органов (и/или их содержимого) из бассейна большого круга кровообращения (почек, печени, сердца, костного мозга и т. д.), поскольку форма и размеры створок диатомовых водорослей влияют на прохождение последних через аэрогематический барьер [6, 24, 26]. Данное обстоятельство закономерно приводит к искажениям таксономического состава диатомовых сообществ указанных органов. Не исключено, что избирательная проницаемость аэрогематического барьера может приводить к увеличению обилий крупноразмерных видов планктона и в лёгких. В связи с этим наиболее предпочтительным объектом ЦСТА со стороны трупа следует считать жидкость из клиновидной пазухи и лёгкие при её отсутствии [27].

Кроме того, чтобы оба сравниваемых экстракта диатомового планктона были приготовлены с использованием одного метода химического разложения. В противном случае разная степень агрессивности, например кислотного и перекисного разложения, приведёт к разрушению панцирей наименее устойчивых видов диатомей, что обязательно негативно отразится на результатах ЦСТА [5, 28, 29].

Точность ЦСТА зависит от корректности идентификации и подсчёта диатомей на этапе исследования изготовленных минерализатов, поскольку метод не заменяет квалификацию альголога, а усиливает её на этапе интерпретации [3, 7].

Часть метрик — индексы Жаккара, Сёренсена–Дайса, процент совпадения доминирующих таксонов, стабильность присутствия и производные от неё композитные индексы — непосредственно зависят от способа определения множества доминирующих таксонов. Представленные в работе пороговые значения указанных метрик получены для метода выделения доминирующих таксонов «топ-3». При использовании иных способов определения доминирования (например, фиксированного порога обилия) необходима дополнительная калибровка порогов на основе имитационного моделирования по аналогии с выполненной в настоящей работе процедурой.

Важным методологическим допущением является фиксация числа доминирующих таксонов на уровне k=3. Хотя теоретически обоснован адаптивный выбор k (например, на основе кумулятивной кривой доминирования), в целях унификации и воспроизводимости результатов в протоколе ЦСТА используется фиксированное значение. Это может снижать чувствительность метода при анализе сообществ с очень низким или, напротив, высоким видовым богатством. Для водоёмов с обеднённой флорой целесообразно рассмотреть возможность увеличения k, что потребует дополнительной калибровки пороговых значений.

При интерпретации результатов ЦСТА следует учитывать, что приведённые в табл. 1 показатели чувствительности и специфичности относятся к каждой метрике в отдельности. Совокупную вероятность ошибочного вывода при одновременном использовании нескольких метрик в условиях комплексного анализа в настоящей работе не оценивали, однако она может отличаться от индивидуальных значений.

Ещё одним ограничением является способ формирования общего пула вероятностей р₀ в бутстрэп-процедуре. Используемое взвешенное среднее нормализованных векторов обилий может приводить к сглаживанию редких таксонов и завышению вклада доминирующих при существенных различиях между пробами. Разработка альтернативных подходов к построению р₀, лишённых этих недостатков, представляет отдельную методологическую задачу. Вопрос о чувствительности результатов бутстрэп-теста к способу построения р₀ также требует дополнительного исследования и выходит за рамки настоящей работы.

Предлагаемый метод ЦСТА представляет пилотную разработку, направленную на формализацию и объективизацию этапа интерпретации результатов диатомового анализа. На данный момент методика не прошла внешнюю валидацию на независимых данных, что является задачей дальнейших исследований. Представленные в работе пороговые значения и операционные характеристики получены исключительно на основе имитационного моделирования и требуют дополнительной проверки в реальных экспертных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод ЦСТА и его программная реализация представляют комплексное решение задачи объективной и статистически валидируемой оценки сходства диатомовых сообществ из предполагаемого водоёма утопления и трупного биоматериала. Предложенный протокол преодолевает субъективность традиционного подхода за счёт использования системы взаимодополняющих метрик, охватывающих интегральное сходство, структуру доминирования и индикаторную значимость отдельных таксонов.

Ключевым элементом работы стало обоснование пороговых значений метрик методом имитационного моделирования Монте-Карло, которое учитывает широкий спектр факторов, приближающих модель к реальным условиям судебно-медицинского анализа: переменное число активных таксонов, эффект редкости, ошибки идентификации и вариабельность объёмов проб. Это позволило для каждой метрики установить количественные критерии «высокого сходства» с контролируемыми уровнями специфичности и чувствительности не менее 95%. Тем самым интерпретация результатов диатомового анализа переводится из области субъективных экспертных оценок в строгую количественную плоскость, обеспеченную статистическими характеристиками.

Внедрение разработанного инструмента в судебно-медицинскую экспертную практику способно повысить доказательную силу, воспроизводимость и стандартизацию заключений по установлению места утопления, что соответствует общей тенденции к цифровизации и внедрению объективных методов в судебно-медицинскую экспертизу.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. В.Г. Недугов — участие в разработке протокола сравнительного анализа, написание кода онлайн-приложения, имитационное моделирование методом Монте-Карло, редактирование текста рукописи, рассмотрение и одобрение окончательного варианта рукописи; Г.В. Недугов — концепция и дизайн работы, разработка протокола сравнительного анализа, тестирование онлайн-приложения, сбор и анализ литературных данных, создание графических материалов, написание и редактирование текста рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Неприменимо.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Авторы сообщают, что все данные представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовал один член редакционной коллегии журнала.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: V.G. Nedugov: methodology, software, formal analysis, writing—review & editing; G.V. Nedugov: conceptualization, methodology, investigation, data curation, visualization, writing—original draft, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: Not applicable.

Funding sources: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously published materials (text, images, or data) were used in this article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This article was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer-review process involved a member of the Editorial Board.

¹ Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2025694798/ 12.12.2025. Бюл. № 12. Недугов В.Г., Недугов Г.В. Qualitative Dual Sample Taxa Analyzer. Режим доступа: https://elibrary.ru/download/elibrary_87704714_29371316.PDF Дата обращения: 17.03.2026.

² Qualitative Dual Sample Taxa Analyzer [Internet]. 2025–2026. Режим доступа: https://forenscalc.ru/plankton-compare Дата обращения: 17.03.2026.

About the authors

Vladimir G. Nedugov

Email: nedugovvg@gmail.com
ORCID iD: 0009-0007-7542-7235
SPIN-code: 2407-7937
Russian Federation, Samara

German V. Nedugov

Author for correspondence.
Email: nedugovh@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7380-3766
SPIN-code: 3828-8091

MD, Dr. Sci. (Medicine), Assistant Professor

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Histograms of the Bray–Curtis and Hellenger distances for 1000 bootstrap pseudo-samples generated for the example data.

Download (111KB)

Indexing metadata